莽草酸激酶作為抗結核分枝桿菌藥物發現靶標的研究進展

李蒙，代曉偉，卞聰，朱小紅，司書毅，李妍，姜威

近年來，隨著結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）單藥耐藥（SDR-TB）、多藥耐藥（MDR-TB）和廣泛耐藥（XDR-TB）菌株的不斷出現和蔓延，使得傳統抗結核藥物的臨床有效率不斷下降，結核病也因此再次成為嚴重危害人類健康和公共安全的傳染性疾病[1-5]。研發新型抗結核藥物，解決結核病治療所面臨的難題成為控制結核病疫情的當務之急。針對傳統藥物進行結構優化或是通過對現有藥物進行組合獲得新的組劑，相對而言是獲得抗結核新藥的捷徑，由此獲得的新藥在特定情況下可提高治療效率，但由于此類藥物在化學結構和作用機制上與傳統藥物無明顯差異，導致其不能有效地避開 MTB 的耐藥機制，對高水平耐藥結核菌無效，仍然不能有效地治療耐藥結核病[6-9]。因此發現新的藥物靶標進而發現新的先導藥物成為抗結核藥物研發的重要方向。

莽草酸途徑是細菌、真菌、藻類、高等植物等合成必需芳香族氨基酸的必需途徑，該途徑合成的分支酸是合成色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及葉酸、泛酸和奎寧酸等芳香型化合物的前體物質[10]。人體內并不存在莽草酸途徑中各個酶的編碼基因，而且目前尚未有以莽草酸途徑為靶標的抗結核藥物應用于臨床，以莽草酸途徑的關鍵酶為靶標的抗結核藥物可能具有有效、低毒且無交叉耐藥的優勢，因此莽草酸途徑中的關鍵酶作為新型抗結核藥物靶標引起了研究者的廣泛關注[11-15]。目前已經發現多個以莽草酸途徑中的關鍵酶為靶標的具有抗結核活性的藥物，其中多數為莽草酸激酶（shikimate kinase，SK）抑制劑，該激酶被認為是莽草酸途徑中最具有潛力的藥物研發靶標[16]。本文就近年來結核分枝桿菌莽草酸激酶（MtSK）結構和功能相關研究及其抑制劑的發現等方面作簡要綜述，為新型抗結核藥物的研發提供參考。

1 MtSK 結構和功能

MtSK 蛋白分子量為 18.58 kD，由aroK基因（Rv2539c）編碼。aroK基因缺失導致 MTB 無法生長，當回補外源性的aroK基因時，突變株得以存活，證明 MtSK 是維持MTB 生長的必需蛋白[17]。在莽草酸途徑中，MtSK 催化第五步反應，它以 ATP 為高能磷酸供體，使磷酰基團從 ATP轉移至莽草酸，從而生成 3-磷酸莽草酸并釋放出 1 個ADP 分子[18-19]（圖1）。

圖1 MtSK 催化反應

MtSK 屬于核苷單磷酸（NMP）激酶家族，MtSK 核心是五股平行的 β-片層結構，兩側有八個 α-螺旋結構[20]。MtSK 包含 NMP 激酶家族共有的三個功能性結構域：①核心結構域，包含五股平行的 β-片層結構和形成核苷酸結合位點的 phosphate-binding loop（P 環，G9-S17，也稱為Walker A-motif）；②LID 結構域（G112-D124 殘基），它封閉在活性位點上，負責打開和關閉催化位點，允許酶與底物和產物相互作用，并具有對 ATP 結合至關重要的殘基；③NMP 結合域（T33-E61，也稱為 SB 結構域），其功能是識別和結合莽草酸[21-22]（圖2）。最近，基于對配體結合的綜合動態分析，有人提出 MtSK 由四個結構域組成：①ESB結構域（擴展 SB；殘基 32-93）；②核苷酸結合（NB）結構域，負責構成核苷酸結合的柔性區域，包括 P 環、AB 環（殘基 148-155）和 101-110 的片段；③LID 結構域（殘基 112-124）；④還原核心（RC）結構域，它覆蓋 NB 結構域和 ESB 部分結構域（殘基 62-93）[18]。RC 結構域是酶最剛性的部分，而 LID 和 NB 結構域是最柔性的部分[21-23]。

圖2 MtSK 晶體結構

莽草酸的羧基端與 R58 和 R136 結合，3-羥基端與D34 和 G80 結合，而 2-羥基與 D34 相結合[24]。Mg2+和ADP 與 P 環、LID 結構域和腺嘌呤結合環中殘基相互作用。MtSK 在底物結合時會發生很大的構象變化，其中 SB和 LID 結構域的結構變化最大。在催化過程中，ATP 首先與酶結合，并誘導 LID 結構域在活性位點上的大幅度移動。之后，莽草酸底物與活性位點結合，LID 結構域在活性位點上方閉合，使 Arg110 和 Arg117 分別進入 ATP 和SB 結構域。莽草酸通過 Arg136 和 Asp34 的側鏈和水網直接和間接結合活性位點[21,25]。

2 MtSK 抑制劑

隨著 MtSK 晶體結構的解析和酶活性檢測方法的建立，建立在虛擬篩選和底物類似物設計、針對 MtSK 三個重要的功能結構域開展的酶抑制劑的篩選也多有報道。目前也已經發現多個 MtSK 抑制劑，并且均表現出良好的抗結核活性。

2.1 基于 MtSK 晶體結構的抑制劑的虛擬篩選和底物類似物的設計

早在 2008年，Segura-Cabrera 和 Rodríguez-Pérez[26]應用 eHiTS 6.2 軟件包模擬 MtSK 的莽草酸結合位點建立虛擬篩選方法，與來自 FAF-Drugs 數據庫的化合物進行對接，以莽草酸和競爭性抑制劑 6-S-氟代莽草酸作為陽性藥物，獲得 644 個得分高于莽草酸底物的化合物，其中 axce1得分最高。得分高的典型化合物具有巰基、三唑或四唑雜環芳烴結構。但是此研究僅限于化合物與晶體結構的虛擬對接和成藥性虛擬評價，并未有酶抑制活性和抗結核活性的檢測。

2010 年，Kumar 等[27]基于 MtSK 開口和閉合晶體結構進行了莽草酸和 ADP 結合位點的關鍵氨基酸分析，并且基于此進行了二肽的合成。進一步對接分析發現最合適的二肽抑制劑是 NH3-Arg-Asp-COO（RD），其與 MtSK 的開口和閉口結構以相似的方式結合，并且占據了幾乎所有可用于結合的口袋空間。RD 與 MtSK 結合的 Kd 值為 5.49 nm，比底物莽草酸的 Kd 值高出約 8000 倍，比 axce1 的 Kd值高 10 倍，因此，二肽 RD 有望成為開發抗結核藥物的先導化合物。Vianna 和 de Azevedo[28]應用 MolDOCK 虛擬篩選 MtSK 抑制劑，對 ZINK 數據庫中的 4580 個化合物中選擇打分在前 20 名的化合物，星形孢菌素是其中之一。進一步的結合位點分析發現這些化合物與激酶的結合主要是在莽草酸結合位點。

基于結構的藥物虛擬篩選評分方法的命中率相對較低，單一靶標和位點的結合打分標準是原因之一，Core Site-Moiety Maps 篩選方法的重點是在靶蛋白共享保守結合位點的情況下，發現多個藥效團，提供有用的指標，以提高篩選的準確性。Hsu 等[29]采用 Core Site-Moiety Maps 方法篩選 MtSK 和 HpSK 抑制劑，發現 6 個新的 IC50低于10 μmol/L 的化合物 NSC45611、NSC162535、NSC45612、NSC45174、NSC45547 和 NSC45609，這些化合物多為 ATP和莽草酸競爭性抑制劑。同時，從 65 種已有的激酶抑制劑發現兩個具有抑制作用的化合物 AG538 和 GW5074。酶動力學分析表明，NSC45611、NSC162535 和 NSC45612 是ATP 和莽草酸的雙重競爭性抑制劑，AG538 是 ATP 的競爭性抑制劑。利用該方法，成功地發現了六種新的 HpSK 和MtSK 抑制劑（8.0 mmol/L）。65 個激酶抑制劑中的兩個也被發現同時抑制 HpSK 和 MtSK 活性。NSC45611、NSC162535 和 NSC45612 是 ATP 和莽草酸的競爭性抑制劑，這表明它們屬于一類新的莽草酸激酶抑制劑。

2013 年，Blanco 等[30]基于結構和分子動力學（MD）模擬研究，分析了 MtSK/ATP/莽草酸以及 MtSK/ADP/三磷酸莽草酸結合過程中的酶的構象變化以及與底物的相互作用關鍵位點，在闡明酶與底物或者產物結合的決定性因素和酶催化轉化所必需的關鍵酶運動的基礎上，設計了莽草酸的結構類似物。類似物包括共形限制莽草酸類似物、羥基衍生物和氨基莽草酸，酶抑制活性研究發現這些類似物都是競爭性可逆的酶抑制劑，Ki 值在 46～1050 μmol/L。構效關系和 MD 模擬研究表明，由于 SK 酶被設計成能夠識別天然底物熱力學上不太穩定的構象，因此那些能夠保持酶所識別構象并導致 LID 和（或）SB 結構域的流動性降低的化合物是開發酶抑制劑的一個很好的策略。

與前面的單一篩選方法不同，2016年，Mehra 等[31]利用已報道的 MtSK 抑制劑的數據進行電子相似性搜索和藥效團建模雙重篩選，在從 ChemBridge 庫 20000 個市售化合物的類似藥物中篩選到 15 個化合物進行進一步的酶活評價，其中兩個苯并噻唑衍生物 5489375 和 5311863 表現出較好的酶抑制活性，IC50分別為（10.69 ± 0.9）μmol/L和（46.22 ± 1.2）μmol/L。對 5489375 深入研究，發現它既不是 ATP 競爭性抑制劑，也不是莽草酸競爭性抑制劑，通過對 5489375 進行分子對接和 MD 模擬分析，發現它可能是結合在 MtSK 的變構位點，抑制了催化產物的釋放，使得激酶無法恢復催化構象，這種機制的研究為 MtSK 抑制劑的虛擬篩選提供了一種新的思路。

2.2 基于 MtSK 活性的抑制劑的發現

在 MtSK 催化過程中，通過檢測 ADP 和 3-磷酸莽草酸的形成或者檢測 ATP 的消耗都可以反映 MtSK 的催化活性。丙酮酸激酶（PK）能使 ADP 和磷酸烯醇式丙酮酸反應生成 ATP 和丙酮酸，后者能夠在 L-乳酸脫氫酶和 NADH 作用下生成 L-乳酸和 NAD+，在OD340nm檢測 NADH 的減少可以間接地反映 ADP 的生成量。基于此，Rajput 等[32]建立了 MtSK 的檢測方法。通過對來自ChemBridge 數據庫的 1000 個具有抗結核桿菌活性的化合物進行酶抑制活性評價，最終發現了 5 個 IC50低于10 μmol/L 的化合物，分別是硫代巴比妥酸鹽、萘醌、噻唑乙腈、查爾酮和噻唑烷二酮。這些化合物都是 ATP 競爭性抑制劑，分子對接發現它們結合在 ATP 結合位點，Arg110是關鍵作用的氨基酸。5 個化合物對標準株 H37Rv 的 MIC在 4～16 μg/ml，對 MDR 菌株也有一定的抑制活性。

2014 年，Zaher 等[33]通過 LC-MS 檢測 3-磷酸莽草酸生成的方法對 404 個具有抗結核活性的化合物進行 MtSK抑制活性的檢測，結果發現 14 個噁二唑酰胺和2-氨基苯并噻唑類化合物，它們的 IC50在 1.94～36.04 μmol/L，細胞毒性小，SI 指數均在 10 以上。但是在 2017年，Alturki等[34]對這 14 個化合物進行分析，發現它們是 MtSK 的非特異性抑制劑，這些化合物在溶液中容易形成聚集體，這可能是它們酶抑制活性和體內活性的原因。它們的抗菌活性可能與其他靶標相關，而不僅僅是 MtSK 抑制。

Mulabagal 和 Calderón[35]使用超濾液相色譜/質譜（UF-LC/MS）檢測化合物與 MtSK 結合活性，液質聯用（LC/MS）檢測化合物對 MtSK 的抑制活性，評估了 4 個化合物對 MtSK 蛋白的抑制作用，其中 3 個化合物是吡唑啉酮類，一個是星形孢菌素，發現 4 個化合物與 MtSK 能夠特異性結合，EC50在 0.07～0.3 μmol/L。

王霞等[36]應用 Kinase-Glo?Plus Luminescent Kinase Assay 試劑盒建立了 MtSK 激酶抑制劑的篩選方法，通過檢測反應體系中 ATP 的消耗量來反映 MtSK 的酶活性。該方法結合恥垢分枝桿菌表型篩選發現了 1 個對 MtSK蛋白有抑制作用的化合物 IMB-T5297，該化合物的 IC50為1.745 μg/ml，與 MtSK 的Kd 值為 21.51 μmol/L，對哺乳動物細胞的毒性很低，但是 IMB-T5297 對標準株 H37Rv、臨床分離耐藥株 XDR 的抑制活性也較低（MIC 分別為49.723 和 47.754 μg/ml）。

2.3 其他 MtSK 激酶抑制劑

除了有目的的 MtSK 抑制劑的發現，在具有抗結核活性的藥物機制研究中也發現多個具有 MtSK 抑制活性的化合物。

多酚類化合物是具有多種生物活性的一類天然產物，不同來源的多酚類化合物也被發現具有抗分枝桿菌的活性。在機制研究中，Pandey 等[37]發現多酚類化合物卡馬拉素具有MtSK 的抑制活性。該化合物對結核分枝桿菌的 IC50在 9～12 μmol/L，而 MtSK 的缺陷株則表現出對卡馬拉素的拮抗。體外酶活檢測發現，在 1.56～100 μmol/L 的濃度下，卡馬拉素表現出對 MtSK 的強抑制活性，在 1.56 μmol/L濃度下，抑制率高于 50%，在 50 μmol/L 濃度下，抑制率接近 100%。分子對接顯示 MtSK 與卡馬拉素的結合能為-8.8 kcal/mol，與 Ser16、Thr17 和 Arg110 表現出極性相互作用。卡馬拉素是 PKC-σ 抑制劑，但是在其作用 2 小時后，PKC-σ 由最初的低表達明顯上升，而卡馬拉素依舊能夠抑制結核桿菌的生長，因此認為卡馬拉素的生長抑制活性是兩個酶抑制的疊加結果。所有這些研究都表明 MtSK是卡馬拉素抗結核活性的重要靶標。

生物堿 manzamine 是一類分離自印度太平洋海綿的化合物，具有廣泛的生物活性。其中 manzamine A 是第一個被分離出來的該類化合物，它在體外表現出良好的抗結核活性，對結核分枝桿菌 H37Rv 的 MIC50值為 1.5 μg/ml，與利福平相當。Simithy 等[38]在該類化合物抗結核機制的研究中，應用 LC-MS 的檢測方法從 26 個衍生物中發現了6 個化合物具有 MtSK 抑制活性，包括 manzamine A、8-hydroxymanzamine A、manzamine E、manzamine F、6-deoxymanzamine X 和 6-cyclohexamidomanzamine A。初步動力學評估表明，這 6 個化合物都是混合的非競爭性酶抑制劑，其中 6-cyclohexamidomanzamine A 對所有形式的MtSK（游離酶、每種酶-底物二元復合物和酶-底物三元復合物）的 Ki 值最低。6-cyclohexamidomanzamine A 與MtSK 的對接模擬預測了該化合物與 MtSK 兩種可能的結合模式，6-環己酰胺部分占據莽草酸結合位點，而在另一個位置則與共結晶的 ADP 重疊。此外，manzamine 可抑制GSK-3β 的活性，并且無細胞毒性。GSK-3β 所調控的通路與結核分枝桿菌逃逸機體免疫相關，因此這類化合物有望用于進一步的研究，從而開發出針對結核分枝桿菌病原體的新候選藥物，對于 6-cyclohexamidomanzamine A 尤其如此。

Ilimaquinone（IQ）是分離自紅海海綿的萜烯醌類化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學活性。Simithy 等[39]發現 IQ 能夠抑制 MtSK 的活性，并呈濃度和時間依賴性，表觀速率常數 Kobs 呈線性增加。在酶反應體系中加入預先孵育的 IQ 與 MtSK，結果發現比后加入IQ 產生的抑制率要高，這一結果說明 IQ 所引起的酶抑制活性應該是緩慢的一步且不可逆失活，二階速率常數（kinact）大約是 60 L/(mol·s)。完整的 MtSK 的質譜驗證支持 IQ 與MtSK 結合的 Michael 加成機制，而蘇氨酸和絲氨酸殘基是 IQ 依賴衍生化的主要靶點，包括 S77、T111 和 S44。IQ 也能衍生和滅活乳酸脫氫酶，但是不能結合丙酮酸激酶（PK）或結核分枝桿菌 KatG（MtKatG），因為四種酶都有大量的絲氨酸和蘇氨酸殘基，但是 IQ 的抑制活性卻并不相同，IQ 對 MtSK 的抑制也沒有十分的特異性，說明 IQ 也具有其他的作用靶位，這限制了 IQ 作為特定靶標抗菌藥物先導化合物的應用。

Sutherlandia frutescens 是南非傳統的中草藥，可用于結核病的治療。Masoko 等[40]從中提取的多個組分具有抗結核活性和 MtSK 抑制活性，其中純化后得到的 α-亞麻酸具有更強的 MtSK 抑制活性，IC50為 0.1 μg/ml。

3 展望

MtSK 蛋白晶體結構的解析使得虛擬篩選成為可能，最初的抑制劑多是通過此方法得到。雖然虛擬篩選得到的化合物多未有后續的酶活性和抗結核活性的報道，提示這種篩選方法的局限性，但是在虛擬篩選研究中，對 MtSK 催化過程中的構象變化、活性位點和關鍵氨基酸有了更為深刻的認識，為基于結構的抑制劑的設計奠定了基礎，隨著計算機虛擬對接技術的發展，針對特定位點的化合物的設計將會推動MtSK 抑制劑的發現。

因為酶活性方法的建立，基于酶活性的抑制劑的篩選近幾年來多有報道，已有的抗結核活性的化合物也發現具有MtSK 抑制活性。但是不管是 LC-MS 的方法，還是基于ADP 或 ATP 檢測的方法，因為檢測儀器或者檢測過程的繁瑣，很難真正實現高通量篩選，而僅僅是配合表型篩選進行的小范圍篩選，因此改進酶活檢測方法對于實現高通量的MtSK 抑制劑篩選十分重要。

總之，目前發現的多個 MtSK 抑制劑具有抗結核活性，并且多個具有抗結核活性的化合物的抗結核機制也與MtSK 抑制相關，這些研究證明 MtSK 作為藥物發現靶標依然具有良好的前景；目前尚未有 MtSK 抑制劑應用于臨床研究，針對該靶標的先導化合物也不容易產生交叉耐藥，因此進一步研究 MtSK 抑制劑的高通量篩選方法，進而發現具有抗結核活性的先導化合物依然具有重要的意義。