天然環庚三烯酚酮類化合物的生物合成及生物活性研究進展

張叢，武臨專，王麗非，洪斌

環庚三烯酚酮（tropolone）類化合物最早在真菌的次級代謝天然產物中被發現，隨后，在細菌次級代謝產物、植物和海洋生物中也發現了此類化合物的存在[1]。它的核心基團為獨特的環七-2,4,6-三烯酮非苯芳香環結構。環庚三烯酚酮類化合物目前已被報道具有廣泛的生物學活性，主要包括抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、殺蟲等作用[2]。構效關系研究表明，一些環庚三烯酚酮類化合物的活性來自于核心的非苯芳香環結構，針對某些生理相關的金屬酶，該結構具有金屬螯合和氧化還原能力[3-5]。本文主要對天然的環庚三烯酚酮類化合物的結構多樣性、生物合成機制以及相關的生物活性報道進行綜述。

1 結構多樣的環庚三烯酚酮類天然產物

1942 年，研究人員最初從一株青霉菌屬（Penicillium stipitatum）真菌代謝產物中提取并分離得到密擠青霉酸（stipitatic acid），然而并沒有確證它的結構[6]。1945年，科學家猜想密擠青霉酸可能包含非苯環的芳香環結構[7]。直到 1950年，該化合物的結構才被證實，即包含七元非苯基芳香環結構，這種結構被命名為環庚三烯酚酮[8]。自此，開啟了人們對非苯環芳香族化合物的研究熱潮。

迄今為止，隨著化學分離技術、測序技術、分子生物學技術的發展，已在真菌、細菌和植物的代謝產物中提取、分離與鑒定了 200 多種天然的環庚三烯酚酮化合物，但是在天然產物中環庚三烯酚酮的核心母核結構依然十分少見[2]。常見的環庚三烯酚酮類化合物根據母核結構上取代基團的性質，取代基團上碳環的數目以及雜原子的存在與否，大體分為 9 類：環庚三烯酚酮和羥基環庚三烯酚酮（hydroxytropolone）、環庚三烯酮（tropone）、歐側柏酚（thujaplicin）及其類似物、環庚三烯酚酮酸、簡單的雙環環庚三烯酚酮、含有一個環庚三烯酚酮單元的多環結構、含有兩個環庚三烯酚酮單元的多環結構、含硫原子的環庚三烯酚酮、含氮原子的環庚三烯酚酮，展現了這一類化合物的結構多樣性（表1）[1,9]。

2 環庚三烯酚酮類化合物的生物合成途徑

隨著越來越多的新環庚三烯酚酮類化合物的發現以及它們多樣的生物活性被報道，吸引人們越來越關注這類化合物的生物合成途徑。了解這類化合物的生物合成途徑，有利于在不同物種中尋找發現新結構的環庚三烯酚酮衍生物，利于對此類化合物進行定向改造，提高特定活性衍生物的產量。在原核生物和真核生物中，環庚三烯酚酮生物合成途徑各不相同。細菌使用莽草酸途徑、苯乙酸代謝或 II 型聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）產生環庚三烯酚酮的核心骨架；而真菌利用非還原性聚酮合成酶（non-reducing polyketide synthase，nr-PKS）途徑；植物利用萜類或生物堿途徑來合成關鍵的七元環部分。盡管合成路線不同，但是在以上途徑中，環庚三烯酚酮的七元環都是由六元環氧化擴環而來。

2.1 莽草酸途徑和苯乙酸代謝

在細菌的代謝產物中發現了環庚三烯酚酮類化合物，引起了人們對這類化合物生物合成途徑的關注。1992年，科研人員利用同位素示蹤的方法在植物病原菌Burkholderia plantarii中發現，葡萄糖可經莽草酸途徑合成苯乙酸，隨后苯乙酸代謝為含有環庚三烯酚酮結構的化合物 tropodithietic acid（TDA）[10]。2012年，通過對合成 TDA 的關鍵酶基因阻斷實驗，證實 TDA 確實起源于莽草酸途徑和苯乙酸代謝偶聯的生物合成途徑[11]。

雙功能酶 PaaZ 是苯乙酸代謝途徑中的關鍵酶。PaaZ的 N 端包含一個醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）結構域，C 端包含烯酰輔酶 A 水合酶（enoyl-CoA hydratase，ECH）結構域。PaaZ 的 ECH 結構域能夠催化氧雜環庚三烯酮環水解斷裂生成半醛結構，ALDH 結構域進一步氧化半醛結構，并在其他酶的催化下將 PAA 降解為2 分子乙酰輔酶 A 和 1 分子琥珀酰輔酶 A[12]。3,7-二羥基環庚三烯酚酮（dihydroxytropolone，DHT）是從鏈霉菌中分離得到的一種具有抗菌、抗癌和抗病毒活性的多羥基環庚三烯酚酮類化合物。Chen 等[13]通過異源表達，基因敲除和生物轉化方法確定了 DHT 的生物合成途徑。在異源宿主天藍色鏈霉菌中，產生 DHT 需要 DHT 生物合成基因簇trl和位于trl基因簇之外的基因簇paa，paa編碼好氧苯乙酸降解途徑相關的酶。天藍色鏈霉菌中存在著與 PaaZ 的 C 端ECH 結構域同源的蛋白 TrlA，但是 TrlA 缺少 ALDH 結構域，從而截斷了苯乙酸分解代謝途徑，為七元環中間體的形成提供更多的苯乙酸前體。TrlB 和 TrlH 促進了苯丙酮酸的從頭合成，從而為鏈霉菌高產生 DHT 提供了豐富的前體。單加氧酶 TrlE 和 TrlCD 催化環庚三烯酮的區域選擇性羥基化生成 DHT（圖1）。這一研究揭示了鏈霉菌中分支酸和苯丙酮酸的合成、苯乙酸的分解代謝和環庚三烯酚酮的生物合成之間的天然聯系。

表1 環庚三烯酚酮類化合物的分類

基于對細菌產生環庚三烯酚酮類化合物生物合成機制的理解，Li 等[14]設計了一條雜合的環庚三烯酮的生物合成途徑，將苯乙酸降解途徑和環庚三烯酮的生物合成相結合，在大腸桿菌中進行重組。為了簡化生物合成途徑的構建，整條生物合成路線最大限度地利用了大腸桿菌內源基因，共分為四個模塊：內源莽草酸途徑、雜合的 PAA 生物合成模塊、內源 PAA 分解代謝模塊和異源的環庚三烯酮生物合成模塊。同時，引入點突變，使 PaaZ 的 N 端醛脫氫酶結構域失活，將碳流重新導向到環庚三烯酮的合成。最終在搖瓶實驗中，利用這種人工設計的生物合成途徑從頭合成環庚三烯酮，最佳效價為（65.2 ± 1.4）mg/L。這一研究結果，為可持續生產環庚三烯酮及其衍生物提供了潛在的策略與方向。

2.2 II 型 PKS 途徑

Isatropolones、rubrolones、isarubrolones 以及 rubterolones等化合物是由放線菌產生的次級代謝產物，它們結構相似，都是具有一個環庚三烯酮環、一個四取代吡啶環、一個環戊酮、一個脫氧糖等的多環化合物。由于這一系列化合物具有廣泛的生物學活性和潛在的工業應用價值，關于它們的生物合成方面的研究相繼開展。

Yan 等[15]利用同位素標記的方法確定在鏈霉菌中rubrolones 的生物合成由 II 型 PKS 催化，核心骨架經過復雜的氧化重排形成環庚三烯酚酮結構。隨后，Yan 等[16]報道了 rubrolones 的生物合成基因簇rub，通過異源表達和基因阻斷實驗證實了 rubrolones 生物合成的關鍵酶屬于II 型 PKS 途徑。生物信息學比較分析 rubrolones 的生物合成基因簇rub，isatropolones 的ist[17]，其中都存在核心的 II 型pks基因和單加氧酶基因，并且具有很高的同源性。在rub和ist內部還存在糖基轉移酶和糖合成相關的基因（圖2A）。

Yan 等[16]對關鍵酶阻斷株的代謝產物結構分析，確定了 rubrolones 的生物合成路線（圖2B）。其中，對糖合成酶基因阻斷時積累中間體，該中間體具有 1,5-二酮部分作為能夠環化的胺受體，通過與氨水或者鄰氨基苯甲酸進行非酶促的縮合和環化反應形成吡啶環，形成 rubrolones 的苷元。隨后，糖合成酶催化生成糖苷[18]，在糖基轉移酶的作用下完成糖基化反應，生成 rubrolones。

Cai 等[17]通過異源表達，中間體結構表征確定了isatropolones 的生物合成途徑，與 rubrolones 生物合成過程相似。Isatropolones 的 1,5-二酮部分能夠與胺反應生成吡啶環，化合物的熒光性質隨胺的結合而改變。由此，紫色的化合物 isarubrolones 是由黃色的化合物 isatropolones 與胺發生反應形成。

圖1 3,7-二羥基環庚三烯酚酮的生物合成途徑

圖2 II 型 PKS 途徑合成環庚三烯酚酮類化合物（A：Rubrolones 生物合成基因簇 rub 和 isatropolones 生物合成基因簇ist 的比較；B：Rubrolones 環庚三烯酚酮環生物合成途徑）

2.3 真菌的 nr-PKS 途徑

青霉菌屬來源的密擠青霉酸是第一個被發現的天然環庚三烯酚酮類化合物，同位素標記的底物飼喂實驗證實密擠青霉酸的環庚三烯酮環并不來自于莽草酸途徑[19]，而是由乙酸鹽和丙二酸鹽為起始原料[20]，經非還原性聚酮合酶催化生成六元苯環[21]，苯環再經過一系列氧化重排擴環反應以及側鏈的氧化最終生成密擠青霉酸。氧化重排包括兩個過程，依賴于 FAD 的單加氧酶 TropB 先將苯環上的 C-3 位羥基化，使其脫芳香化，然后由非血紅素 Fe2+依賴的雙加氧酶 TropC 催化 3-甲基羥基化，完成第二次氧化擴環重排，形成七元的非苯基芳香環庚三烯酚酮環（圖3）[22]。

圖3 密擠青霉酸生物合成中的氧化擴環反應過程

2.4 植物的萜類或生物堿途徑

在植物中同樣分離得到了多種天然環庚三烯酚酮類化合物，如秋水仙堿、β-thujaplicin 等。植物通過萜類和（或）生物堿途徑產生環庚三烯酚酮部分，其中七元環也是由六元苯環經氧化擴環而形成。

利用同位素示蹤方法研究β-thujaplicin 的生物合成過程，結果顯示，β-thujaplicin 核心結構來源于檸檬烯骨架，通過選擇性氧化反應和 C-C 鍵斷裂重排形成環庚三烯酮環[23]。

在自然界中存在著大量秋水仙堿的類似物，由于它們復雜、特殊的化學結構，獨特的生物功能，對這一類化合物的生物合成研究由來已久。秋水仙堿的環庚三烯酮結構來源于酪氨酸和苯丙氨酸，通過甲基化作用、氧化反應、苯酚偶聯過程得到中間體，中間體六元環外部的 C-C 鍵斷裂，進而發生重排形成七元環結構[24]。Nett 等[25]結合轉錄組學、代謝分析從嘉蘭（Gloriosa superba）中發現了 8 個與秋水仙堿的前體N-甲酰秋水酰胺生物合成相關的酶，以及一個非經典細胞色素 P450 酶，該 P450 酶能夠催化產生環庚三烯酮七元環骨架所必需的擴環反應。隨后，研究人員將新發現的基因及其他必需的基因在本氏煙（Nicotiana benthamiana）中異源表達，實現了從氨基酸到N-甲酰秋水酰胺的人工生物合成，解析并重構了近乎完整的秋水仙堿生物合成通路。

3 環庚三烯酚酮類化合物的生物活性

天然的環庚三烯酚酮類化合物大多是植物或微生物的次級代謝產物，因其結構的多樣性獲得了多種的生物學活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎和殺蟲活性等。

3.1 抑菌活性

大多數環庚三烯酚酮類化合物都具有抑菌活性，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑菌或殺菌作用，多數作用在細菌的細胞膜或細胞壁，造成細菌溶解。最早在 1938年，在環庚三烯酚酮結構還沒提出之前，就已經發現β-thujaplicin對結核桿菌和其他細菌有顯著的抑制活性[1]。TDA 在低微摩爾濃度下對多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和子囊菌有明顯的抑制作用[1]。莢膜多糖是細菌表面的一層黏液層，有利于免疫逃避和感染，雙功能金屬酶 CapF 是某些致病菌在莢膜多糖生物合成途徑中重要的抗菌靶標?；衔?3-異丙烯基-環庚三烯酚酮（3-isopropenyl-tropolone）抑制 CapF催化的反應，擾亂莢膜多糖的關鍵前體的合成，從而達到抑制金黃色葡萄球菌的作用[26]。馬鈴薯瘡痂病由瘡痂鏈霉菌（Streptomyces scabies）引起，研究發現 isatropolone C 有抑制瘡痂鏈霉菌的活性[27]。

環庚三烯酚酮類化合物對真菌同樣有抑制作用。新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）是一種常見于免疫抑制患者的病原體，研究人員通過藥物篩選發現含有硫酯鍵的環庚三烯酚酮類化合物對隱球菌有殺菌作用，最小抑菌濃度（MIC）為 0.2 μmol/L，對肝細胞毒性小，治療指數高，有望開發成新型抗隱球菌藥物[28]。

3.2 抗病毒活性

環庚三烯酚酮類化合物的抗病毒活性主要表現為對人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）及丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的抑制作用。

HIV-1 逆轉錄酶核糖核酸酶 H（RNaseH）具有四種酶活性，對病毒復制至關重要，并且其催化活性需要金屬離子的參與，而環庚三烯酚酮和羥基環庚三烯酚酮具有螯合金屬離子的能力，能夠抑制 RNase H 的活性，是潛在的抗 HIV候選藥物[29]。2,7-二羥基環庚三烯酚酮能夠緊密結合 Mg2+，表現出較高的金屬親和力，是 HIV-1 相關核糖核酸酶的有效和選擇性抑制劑[30]。以此機制，Gao 等[31]優化設計了一系列環庚三烯酚酮類衍生物，保留其螯合金屬離子的基團，這些化合物相較于β-thujaplicinol，抑制 RNase H 的活性更高。

由 HBV、HCV 感染引發的慢性肝炎、肝硬化和肝癌等疾病嚴重威脅著人類的健康，目前臨床上治療慢性肝炎病毒感染尚不能達到 100% 清除病毒的程度。HBV 通過逆轉錄病毒前基因組 RNA 來復制其基因組，而RNaseH 能夠通過破壞已復制的病毒 RNA 產生雙鏈 DNA，因此RNaseH 成為抑制 HBV 復制的靶點[32]。同樣，2,7-二羥基環庚三烯酚酮因其對金屬離子的螯合能力可作為抗 HBV候選藥物[30]。3,7-二溴-5-(嗎啉-4-甲基)環庚三烯酚酮是HCV 解旋酶的強抑制劑[33]。

單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）-1 是一種大型雙鏈DNA 病毒，感染了超過一半的美國人口，含有親脂性側鏈的 α-hydroxytropolones 對皰疹病毒具有很好的抑制活性[34-35]。

3.3 抗腫瘤活性

除了抗病原微生物的作用，對環庚三烯酚酮類化合物的抗腫瘤作用研究也比較廣泛和深入。含有環庚三烯酚酮七元環的天然產物具有金屬結合和氧化還原特性，是人類癌細胞生長的有效抑制劑。β-thujaplicinol 能夠抑制畸胎癌細胞 F9的生長，影響分化進行，誘導細胞死亡[36]。Eglerisine 是一個包含環庚三烯酚酮骨架的倍半萜類化合物，對人類急性髓系白血病細胞系 Kasumi-1 具有抗增殖作用。其既不是通過凋亡，也不是通過壞死機制誘導細胞死亡，而是通過磷酸化H2AX 組蛋白，減少 S 期，增加細胞周期的 G2 期，使細胞周期在 72 h 后停止，從而造成細胞的絕對數目減少[37]。藜屬植物Chenopodium albumLinn 中分離得到的一系列環庚三烯酚酮類衍生物對人肝癌細胞 HepG2 的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶水平均勻顯著的保護作用，并對該細胞系具有一定的抗增殖活性[38]。對多種實體瘤及癌細胞系體外活性篩選結果表明，環庚三烯酚酮類化合物展現多樣的抗腫瘤活性[39]。

3.4 抗炎活性

秋水仙堿是研究最深入的植物代謝物之一，具有抗有絲分裂、抗纖維化和抗炎的作用，已被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準為抗痛風、家族性地中海熱、繼發性淀粉樣變性病和硬皮病的藥物[2]。2,5-dihydroxycyclohepta-2,4,6-rienone（AD-4）在大鼠炎癥模型中具有抗炎作用，且毒性低于對照藥吲哚美辛，AD-4 顯著降低透明質酸酶誘導的毛細血管通透性，推測其抗炎功能可能與改變血管透性的功能相關[40]。Rubterolones 可適度降低人單核細胞前列腺素E2（PGE2）的細胞水平，部分抑制微粒體前列腺素 E2合成酶-1（MPGES1）的活性[41]。

3.5 殺蟲活性

有些環庚三烯酚酮類化合物具有殺蟲活性。如從北美香柏中分離的包含環庚三烯酮類化合物的精油對熱帶地區儲藏谷物中的害蟲Callosobruchus maculatus有防治效果[42]。不同濃度β-thujaplicin 與曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）尾蚴共同孵育，利用透射電子顯微鏡觀察，顯示隨著暴露時間的持續和暴露濃度的增加，尾蚴由超微結構變化發展為皮被和更深的實質結構變化，從而不能感染宿主，說明β-thujaplicin 對曼氏血吸蟲幼蟲有殺蟲效果[43]。Isatropolones 是杜氏利什曼原蟲（Leishmania donovani）有效的特異抑制劑，而 rubrolones 的殺蟲活性較 isatropolones低，提示 isatropolones 的吡喃結構可以提高環庚三烯酚酮結構對杜氏利什曼原蟲的殺蟲活性[17]。秋水仙草中分離的一系列環庚三烯酚酮類生物堿對大利什曼原蟲（Leishmania major）有較強的殺滅作用，且溶血活性和細胞毒性較低，具有較好的開發前景[44]。

3.6 其他生物活性

自噬是一種細胞的程序性死亡方式，負責清除冗余大分子或受損細胞器，以達到維持細胞穩態的目的。越來越多的研究表明自噬調節有望成為腫瘤、免疫系統疾病、心肌病等疾病的治療靶點。Isarubrolones 和 isatropolones 類似物在人肝癌細胞 HepG2 中通過降低 ATG4a 水平，增加ATG7、ATG5 和 ATG4b 等泛素樣酶水平，促進自噬體的形成，觸發自噬過程[45]。抑制半胱氨酸蛋白酶 Atg4B 可以阻斷自噬，benzotropolones 以 Atg4B 為靶點，可以顯著減緩腫瘤生長并增強經典化療的效果[46]。

來源于放線菌的 rubrolone A 和 rubrolone B 可以顯著增加過氧化氫誘導損傷的新生大鼠心肌細胞的再生能力，提示 rubrolones 具有心肌保護作用[15]。β-thujaplicin 局部治療可明顯抑制小鼠的牙槽骨丟失和破骨細胞分化，具有開發成為治療牙周炎藥物的潛力[47]。

4 總結與展望

天然的環庚三烯酚酮化合物的化學結構具有多樣性，并且具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎和殺蟲等多種生物活性，是潛在候選藥物和農業應用的重要來源。本文著重介紹了天然的環庚三烯酚酮類化合物的生物合成途徑和生物活性。

但是，該類化合物的開發仍存在一定的瓶頸：一些活性化合物同時對有益微生物和哺乳動物有較強的細胞毒性[48]；相較于結構多樣的天然環庚三烯酚酮類化合物，只有少部分化合物的生物合成途徑得到解析，對于生物合成過程中關鍵酶的功能報道仍十分有限；一些分子結構的具體形成機制也并未解析清楚，導致對于復雜的化合物如rubrolones 等尚不能被全合成[18]；對不同生物活性的環庚三烯酚酮化合物的藥物機制研究仍待深入，這些因素制約著該類化合物的進一步開發應用。

針對以上問題，將近期蓬勃發展的合成生物學方法應用于這一類化合物的研究可能會突破瓶頸。首先，需要不斷地解析天然環庚三烯酚酮類化合物的生物合成途徑，確定更多的生物合成關鍵酶的功能，建立并豐富遺傳元器件庫。在此基礎上，一方面可采用基因組挖掘技術發現新的天然產物；一方面可引入工程學思想，通過對合成必需的遺傳元件的重組，合成通路的合理設計，人工創造新結構的化合物。大量新結構環庚三烯酚酮類化合物的積累為進一步篩選新活性或活性高、毒性低、成藥性強的化合物奠定基礎，加速該類化合物的應用。