p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測對HSIL+病變診斷的臨床價值

簡鳳萍 羅燕艷 梁銳根 徐秀梅 鄧文同

1 中山市博愛醫院婦產科 (中山 528400)

2 中山市博愛醫院病理科 (中山 528400)

宮頸癌是一個全球性的問題, 位居女性生殖道腫瘤第一位, 35 歲以下惡性腫瘤第一位[1-2]。 中國宮頸癌發病率15/10 萬, 近年來發病趨勢明顯年輕化, 且早期患者增多[3]。 50 年以來大部分國家宮頸癌還以細胞學篩查為主, 但是細胞學靈敏度較低, 而HPV 初篩的臨床應用缺點是具有特異度較低等局限性[4]。 近年來細胞學與HPV 檢測聯合篩查策略逐漸成為宮頸癌篩查共識。 穆啟梅等[5]探討了TCT、 HPV-DNA 分型檢測在細胞檢查結果≥ASCUS 和病理組織學檢測≥CINⅠ患者的癌前病變篩查價值。 而WHO 發布的最新的宮頸疾病分類依據[6]認為包括CIN2 和CIN3 在內的HSIL 早期診斷給婦產科醫師帶來的挑戰是巨大的。 而有創的病理活檢常常不容易被接受。 探討一種無創性的早期HSIL+顯得非常迫切而重要。

本研究通過縱向比較 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測在不同級別宮頸病變的陽性率的差異, 橫向比較p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測在相同宮頸病變的陽性率的差異, 綜合評估 p16/Ki- 67 染色、 HPV E6/E-7mRNA 和聯合檢測診斷HSIL +病變效能的差異,旨在建立一種靈敏、 特異、 無創的HSIL +病變早期診斷方法。

1 資料與方法

1.1 材料收集

選取2017 年3 月—2020 年8 月期間, 于中山市博愛醫院婦產科就診, 組織學證實為宮頸炎患者209 例、 LSIL 患者 169 例、 HSIL 患者 131 例和宮頸癌患者86 例作為研究對象。 宮頸炎組患者年齡23 ～78 歲, 平均年齡 (41.9 ± 12.6) 歲; LSIL 組患者年齡 21 ～81 歲, 平均年齡 (42.3 ± 11.2)歲; HSIL 組患者年齡25 ～79 歲, 平均年齡 (43.6±9.8) 歲; 宮頸癌組患者年齡25 ～82 歲, 平均年齡 (43.5 ±13.0) 歲; 四組間年齡差異無統計學意義 (P＞0.05), 具有可比性。 入選標準: 研究對象均為宮頸原發性疾病; 未合并有其他腫瘤; 未接受過宮頸疾病的藥物、 放化療及靶向治療; 非生理期、 非妊娠期、 非哺乳期。

1.2 設備與試劑

P16/Ki-67 染色抗體由美國 Ventana Medical Systems 公司生產。 HPV E6/E7mRNA 分子檢測儀、ThinPrep2000 細胞制作儀購自美國 Hologic 公司。HPV E6/E7mRNA 檢測試劑由科蒂亞生物公司生產。

1.3 標本制作與診斷

由婦產科醫師采集患者宮頸標本并制作宮頸細胞薄片, 在陰道鏡下, 采集宮頸病理標本, 固定、脫水、 包埋、 透明、 浸蠟、 包埋、 切片、 染色, 按參考文獻執行[7]。 組織學診斷由2 位病理醫師共同完成。

1.4 宮頸組織學診斷依據

宮頸組織學診斷結果依據WHO 發布的最新的Bethesda[6], 包括宮頸炎 (良性細胞改變)、 LSIL、HSIL、 宮頸癌。 LSIL 相當于原來的 CIN1, HSIL 相當于原來的CIN2 和CIN3。

1.5 p16/Ki-67 染色檢測

利用免疫學抗原抗體分子由于結構的互補和彼此親和性所發生特異性結合原理, 并通過氧化還原化學反應使標記抗體的酶顯色劑顯色來確定細胞內抗原, 對其進行定位、 定性。 實驗設置陰陽性對照。 檢測結果由病理醫師在光學顯微鏡下對染色后薄片進行觀察并進行判斷。 陽性染色結果是指薄片中見一個以上細胞的細胞核呈紅色著色、 細胞質呈黃色。 陰性染色結果是指薄片中除外同一細胞的細胞核呈紅色著色、 細胞質呈黃色的所有情況[8-9]。見圖1。

圖1 p16/Ki-67 染色圖像 (Envision 法, ×400)

1.6 HPV E6/E7mRNA 檢測

采用HPV E6/E7mRNA 分子檢測儀進行診斷,可檢測 HPV16、 18、 31、 33 在內的 14 種高危型HPV。 HPV E6/E7mRNA 檢測結果為陽性 (紅色)、陰性 (黑色)。

1.7 聯合檢測

本實驗中p16/Ki-67 和HPV E6/E7mRNA 聯合檢測采用并聯的方式: 即兩個實驗結果中只要有一個為陽性即診斷為聯合檢測陽性。 只有兩個實驗結果同時為陰性才診斷為聯合檢測陰性。

1.8 統計學處理

使用SPSS 24.0 統計學軟件完成數據分析, 率的比較采用χ2檢驗, 均數的比較采用方差分析 。HSIL+為本研究的終點 (包括HSIL 和宮頸癌)。HSIL- (包括 LSIL 和宮頸炎)。P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測在不同級別宮頸病變的陽性率的比較

p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測陽性率隨宮頸病變程度的加重呈趨勢性升高(p16/Ki-67 染色:χ2=374.34,P＜ 0.001; HPV E6/E7mRNA 檢測:χ2=289.21,P＜ 0.001; 聯合檢測檢測:χ2=343.90,P＜0.001), 見表 1。

表1 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測陽性率與宮頸病變橫向和縱向的比較 %

2.2 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測在相同級別宮頸病變的陽性率的比較

在宮頸炎、 LSIL、 宮頸癌組, p16/Ki-67 染色、HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測陽性率之間差異均不具有統計學意義 (均P＞0.05)。 而在 HSIL 組,p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測陽性率總體差異有統計學意義 (χ2= 12.23,P=0.002)。 進一步兩兩比較發現: 在HSIL 組, p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 檢測之間陽性率差異不具有統計學意義 (χ2= 0.29,P= 0.29);p16/Ki-67 染色和聯合檢測之間陽性率差異有統計學意義 (χ2=8.09,P=0.004); HPV E6/E7mRNA和聯合檢測之間陽性率差異有統計學意義 (χ2=11.30,P=0.001), 見表 1。

2.3 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測診斷HSIL+病變效能比較

表2 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測診斷HSIL+病變效能比較

本文以組織學診斷結果為金標準, p16/Ki-67染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測診斷HSIL +病變的靈敏度、 特異度、 符合率見表2。 三種檢測方法診斷HSIL +的靈敏度, 總體差異有統計學意義 (χ2= 7.69,P= 0.021)。 進一步兩兩比較,p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 檢測法之間的靈敏度差異不具有統計學意義 (χ2=0.27,P=0.61); p16/Ki-67 染色與聯合檢測法之間的靈敏度差異有統計學意義 (χ2= 7.29,P= 0.007);HPV E6/E7mRNA 檢測與聯合檢測法之間的靈敏度差異有統計學意義 (χ2=4.84,P=0.028)。 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測診斷HSIL +的特異度及符合率的總體差異不具有統計學意義0.628)。

3 討 論

35 ～64 歲需要接受宮頸癌篩查的中國女性約3 億, 宮頸癌篩查不是一道單選題, 理想的宮頸癌篩查方案應該是篩查益處最大化: 敏感性高,及早發現高級別癌前病變及已患浸潤癌人群; 無痛、 無創、 成本低廉, 病人依從性好; 更加明確的臨床管理。 潛在危害最小化: 特異性高、 找出真正向宮頸癌進展的病變; 簡單的判讀方式, 減少人為主觀因素對結果的影響; 減少一過性HPV感染帶來的心理壓力和不必要的創傷檢查。 細胞學、 組織病理學、 陰道鏡醫師缺乏規范化培訓和質量控制參差不齊是目前國內宮頸癌篩查水平差距較大的主要原因。

2014 年WHO 女性生殖系統腫瘤推薦p16/Ki-67 用于宮頸病變輔助診斷[10]。 劉玉艷等[11]研究發現: p16/Ki-67 染色可提高細胞學檢測的敏感性和HPV 檢測的特異性, 有效提髙宮頸癌篩查效率。陳飛等[12]研究認為: HPV E6/E7mRNA、 p16 /Ki67 表達與宮頸病變程度密切相關, 可輔助ASCUS 患者的分流診斷。

mRNA 是一大類RNA 分子, 它將遺傳信息從DNA 傳遞到核糖體, 在那里作為蛋白質合成模板并決定基因表達蛋白產物肽鏈的氨基酸序列。 E6、E7 是高危型HPV 病毒的兩致癌基因, 是導致宮頸發生高級別病變乃至癌變的元兇。 在病毒感染的早期, E6、 E7 基因處于靜默期, 不表達或者低表達mRNA, 一過性HPV 感染大多處于這個階段。 約4/5 的女性一生當中都曾感染過HPV, 但大部分感染會在一到兩年內自動清除或者被自身免疫力抑制, 不會呈持續性的陽性狀態。

p16 是腫瘤抑制因子, Ki-67 是細胞增殖標志物, 在正常細胞周期中, p16 和Ki-67 不會同時表達在同一個細胞中。 反之, 如果p16 和Ki-67 同時表達在同一個細胞中, 說明細胞增殖失控, 極大概率提示宮頸高度病變和宮頸癌的發生。

表1 從縱向比較了p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測陽性率隨宮頸病變程度的加重而升高, 反映出 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E-7mRNA 和聯合檢測與宮頸癌的發生是緊密相關的。這一研究結果與Daniela G[13]及Liu TY[14]等報道p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 檢測與宮頸癌發生密切關聯的研究結論一致。

表1 還從橫向比較了宮頸炎、 LSIL、 宮頸癌組, p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測陽性率之間差異均不具有統計學意義 (均P＞0.05)。 而有趣的是在 HSIL 組, p16/Ki-67 染色、HPV E6/E7mRNA 和聯合檢測陽性率總體差異有統計學意義 (χ2=12.23,P=0.002)。 對于 HSIL 病例的早期診斷正是臨床醫師重點關注的病例, 而恰好p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 聯合檢測能更有效甄別這部分病例, 對于預防宮頸癌的發生具有重要的臨床價值。 這一實驗結論與王茂等[15-16]報道相一致。

本研究從重點考察指標靈敏度、 特異度、 符合率等報道 p16/Ki-67、 HPV E6/E7mRNA、 聯合檢測診斷HSIL+病變的臨床價值, 表2 的研究結果反映出三種檢測方法均可應用于HSIL+病變的篩查, 但是聯合檢測能顯著提高HSIL +病變診斷的靈敏度,降低漏診率, 同時保持了較好的特異度和符合率,建議將p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 聯合檢測作為早期診斷HSIL+病變的策略。

與此同時, 我們應該看到聯合檢測在有效提高篩查靈敏度的同時, 降低了特異度, 而且增加了患者的經濟負擔。 如何甄別聯合檢測的假陽性病例,確保其特異性, 而且進一步合理聯合檢測的費用,這是擺在婦產科醫師和病理醫師面前的機遇和挑戰, 如果能解決這些問題, 將會使更多宮頸癌前病變患者被早期發現, 為女性的生命健康保駕護航。