miR-16聯(lián)合Cripto-1、ANXA7診斷胃癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值研究

謝 宇，李會(huì)穎，林永娟，孫 巖

1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科；江蘇南京 210008；2.江蘇省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，江蘇南京 210009

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國(guó)是胃癌的高發(fā)國(guó)家，其每年新發(fā)病例數(shù)占全球的40%以上[1]。多數(shù)胃癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于癌癥中晚期，導(dǎo)致患者臨床預(yù)后不佳[2]。目前一致認(rèn)為，早期發(fā)現(xiàn)胃癌并采用合理的方案進(jìn)行干預(yù)治療，有助于提高患者生存率，并改善預(yù)后[3]。微小核糖核酸(miRNA)是可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的非編碼RNA，有研究結(jié)果證實(shí)其在腫瘤的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中扮演十分重要的角色[4]。研究表明，miR-16在胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等患者體內(nèi)水平異常，其可能在惡性腫瘤的診斷和評(píng)估中起重要作用[5]。畸胎瘤衍生生長(zhǎng)因子(Cripto-1)是可有效維持胚胎干細(xì)胞和多能性干細(xì)胞的標(biāo)志物，有學(xué)者指出，在多種腫瘤組織中Cripto-1表達(dá)處于異常活躍狀態(tài)，且在癌變前其水平即會(huì)出現(xiàn)明顯升高[6]。膜聯(lián)蛋白A7(ANXA7)是近年來被廣泛研究的熱點(diǎn)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、凋亡、鈣離子信號(hào)及生長(zhǎng)等生物學(xué)功能，且在多種腫瘤中均呈現(xiàn)明顯異常表達(dá)狀態(tài)[7]。目前，miR-16聯(lián)合Cripto-1、ANXA7在胃癌早期診斷中的應(yīng)用報(bào)道較少，因而本研究對(duì)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院收治的胃癌患者進(jìn)行分析，探討miR-16聯(lián)合Cripto-1、ANXA7診斷胃癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2019年9月于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院內(nèi)科治療的胃部疾病患者546例作為研究對(duì)象，根據(jù)是否符合胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]分為胃癌組(121例)和非胃癌組(425例)。其中胃癌組患者根據(jù)胃癌進(jìn)展情況分為早期胃癌組(44例)和進(jìn)展期胃癌組(77例)；根據(jù)淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(71例)和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(50例)。非胃癌組中男261例，女164例；平均年齡(67.38±8.32)歲；胃炎206例、胃潰瘍182、其他37例。選擇同期該院體檢健康者50例作為對(duì)照組，其中男29例、女21例，平均年齡(68.03±6.31)歲。各組受試者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。胃癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)組織病理學(xué)檢查確診為胃癌；(2)入組前未接受化療、放療、免疫療法治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重肝、腎系統(tǒng)疾病；(2)合并其他結(jié)締組織病；(3)精神異常無法配合本研究。

1.2方法 晨起空腹時(shí)抽取靜脈血3 mL置于離心管中，2 500 r/min離心15 min，取上清液500 μL至小型離心管中保存，按照總RNA快速提取試劑盒說明書從中提取總RNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-16水平，并以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-16水平，所用引物均購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。miR-16引物設(shè)計(jì)如下，上游:5′-ATC AAG CTT ATC AGA CAA GC-3′，下游:5′-ATG TGC CCG GTC AGA GGC-3′。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)血清ANXA7、Cripto-1水平，試劑盒購(gòu)自南京福麥斯生物科技有限公司。

2 結(jié) 果

2.1各組miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比較 胃癌組血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平高于對(duì)照組和非胃癌組(P<0.05)，見表1。

表1 各組miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比較

2.2不同胃癌亞組患者miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比較 進(jìn)展期胃癌組血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平均高于早期胃癌組(P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，見表2。

表2 不同胃癌亞組患者miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比較

2.3miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌的價(jià)值 miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌的最佳臨界值分別為11.81、71.51 μg/L、2.26 μg/L，3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷胃癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.996，其靈敏度(95.04%)和特異度(97.26%)較高，見表3。

表3 miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌的價(jià)值

2.4miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值 miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最佳臨界值分別為18.95、78.93 μg/L、3.73 μg/L，3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC為0.996，其靈敏度(97.18%)和特異度(96.00%)較高，見表4。

表4 miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值

2.5血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平的相關(guān)性分析 胃癌患者血清miR-16水平與ANXA7、Cripto-1水平均呈正相關(guān)(r=0.465、0.519，均P<0.05)。

3 討 論

胃癌是現(xiàn)階段我國(guó)最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，目前呈現(xiàn)明顯的年輕化趨勢(shì)，且臨床發(fā)病率逐年升高。有研究指出，胃癌早期缺乏特異性的體征和癥狀，導(dǎo)致無法被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)進(jìn)行診治時(shí)，大多數(shù)患者已發(fā)展到進(jìn)展期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)[8]。因而有學(xué)者指出對(duì)胃癌進(jìn)行早期診斷和評(píng)估，并及時(shí)預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)臨床救治具有十分重要的意義[9]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸屬于連續(xù)性、多階段、多因素的病理過程，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及原癌基因及抑癌基因的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)變化，所以選擇合適的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)胃癌進(jìn)行判斷，具有一定的理論依據(jù)[10]。

有研究表明，miR-16在多種惡性腫瘤患者體內(nèi)均呈現(xiàn)異常表達(dá)狀態(tài)，包括miR-16在內(nèi)的多種miRNA具有評(píng)估惡性腫瘤患者轉(zhuǎn)移、分期和預(yù)后的價(jià)值[11]。ANXA7在惡性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞中均呈現(xiàn)明顯的異常表達(dá)狀態(tài)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[12]。Cripto-1是從人類NTERA-2畸胎瘤cDNA中分離和克隆的表皮生長(zhǎng)因子家族結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，在胚胎發(fā)育過程中起不可或缺的作用[13]，有效參與并調(diào)控腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)[14]。本研究表明胃癌組患者血清ANXA7、miR-16、Cripto-1水平高于對(duì)照組及非胃癌組，有相關(guān)研究顯示，在胃癌細(xì)胞中ANXA7蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈線網(wǎng)狀或黃色顆粒分布，且其在胃癌細(xì)胞中的水平明顯高于正常細(xì)胞[12-14]。進(jìn)展期胃癌組血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平高于早期胃癌組。進(jìn)一步分析顯示，miR-16、ANXA7、Cripto-1這3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷胃癌的AUC為0.996，有較高的靈敏度和特異度，3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC為0.996，也有較高的靈敏度和特異度。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌患者血清miR-16水平與ANXA7、Cripto-1水平均呈正相關(guān)。此前，有相關(guān)報(bào)道也顯示在胃癌組織中多種miRNA呈現(xiàn)明顯的異常表達(dá)狀態(tài)，且相關(guān)miRNA水平隨淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而升高，因而推測(cè)miRNA可作為影響胃癌患者病情進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。Cripto-1可與膜相關(guān)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1特異性結(jié)合，激活酪氨酸激酶，并活化Akt信號(hào)通路，具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和浸潤(rùn)的作用。此外，生長(zhǎng)因子β配體還可與Cripto-1形成復(fù)合物，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)，加速腫瘤細(xì)胞增殖。分析認(rèn)為miR-16、ANXA7、Cripto-1相互影響，且可能隨著患者病情進(jìn)入進(jìn)展期和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，患者的腫瘤負(fù)荷增大，導(dǎo)致腫瘤組織釋放大量與原癌基因作用的miRNA和蛋白質(zhì)進(jìn)入血液，引起各指標(biāo)水平明顯升高。3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用可有效診斷胃癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可從多角度對(duì)患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的變化狀態(tài)進(jìn)行有效評(píng)估，所評(píng)估的結(jié)果相對(duì)更為精準(zhǔn)。

綜上所述，血清miR-16、Cripto-1、ANXA7在胃癌患者中水平升高，且進(jìn)展期患者和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的上述指標(biāo)水平明顯高于早期胃癌患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，表明隨著病情加重，血清miR-16、Cripto-1、ANXA7水平升高，miR-16水平與Cripto-1、ANXA7水平呈正相關(guān)，3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用可有效診斷胃癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，具有較高的臨床價(jià)值。