基于氣相色譜-離子遷移譜對百里香揮發性成分的分析

劉娟，趙歡蕊，付咪咪，段義忠

(榆林學院 生命科學學院，陜西 榆林 719000)

百里香又名麝草香，屬雙子葉唇形科芳香植物，是一種株型奇特矮小的亞灌木，花冠紫紅,色澤艷麗，于盛花期間散發特有的麝香香味，香味獨特,回味悠長，因其特有的芳香氣味，自古以來作為一味重要的調味品被廣泛應用于食物烹調，在西方國家尤為流行[1]。作為一種中西方應用歷史已久的香料植物，干燥的百里香粉或葉片可用于制作調味香料，被加入到牛羊肉等肉類的制作中用以除膻、提香，使肉湯湯鮮味美，食之令人食欲大增，因此深受消費者的喜愛[2-5]。除了具有濃郁的芳香氣味外，百里香還具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗衰老、美容養顏等功效，其中揮發性化合物被認為是其發揮生理功效的關鍵物質，其主要提取物百里香酚、香荊芥酚具有較強的殺菌、防腐及抗氧化等活性，被廣泛應用于食品添加劑、藥品等行業[6-9]。

氣相色譜-離子遷移譜(GC-IMS)聯用技術是利用氣相離子的電場遷移速率差異進而對離子進行分析鑒定，集合了氣相色譜高分離度和離子遷移譜高分辨、高靈敏等優點，特別適用于揮發性有機化合物的痕量檢測[10]。與傳統的氣質聯用技術相比，GC-IMS技術對樣品處理及分析的溫度更低，更利于熱穩定性較差的揮發性化合物的檢出，其次，氣相離子在經過氣相色譜的初步分離后，在離子遷移譜中實現了進一步的分離，其分離能力較普通色譜更強，此外，還具有儀器體積小便于攜帶、常壓工作后期維護成本低等多重優勢，因此，氣相離子遷移譜技術在食品揮發性物質的檢測、食品質量把控等領域具有較好的應用前景。

百里香揮發性成分含量低、組成復雜、易揮發、不穩定，現有的分離與檢測技術還存在著各種各樣的限制，而利用GC-IMS技術對百里香揮發性成分分析的研究鮮有報道，因此，本研究選取GC-IMS聯用技術對百里香中的揮發性成分進行分析研究，旨在為百里香資源的進一步開發利用提供理論依據，也為快速、高效分析百里香揮發性化合物拓寬了思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百里香：于2019年5～9月間取自陜西榆林臥云山地區。標準對照品：麝香草酚(thymol)純度>99%，批號100508-200301，中國藥品生物制品檢定所；香荊芥酚(carvacrol)純度>98%，批號2078896，上海瑞楚生物科技有限公司；無水乙醇(色譜純)：天津四友精細化學品有限公司；水為超純水。

CTC Combi-PAL自動頂空進樣器 丹麥Densensor公司；Flavour Spec氣相色譜-離子遷移譜聯用儀：配有Laboratory Analytical Viewer (LAV)分析軟件及GC-IMS Library Search定性軟件(內置NIST 2014保留指數數據庫和G.A.S.漂移時間數據庫) 德國 G.A.S公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 百里香樣品的制備

將采摘的百里香全草，去除根、莖稈后，人工將百里香花、葉進行分離，陰干備用。百里香花期較短，根據采摘時間的不同將樣品分為F1采收期(5月20日采摘)和F2采收期(6月20日采摘)，樣品編號為F1和F2。百里香葉片則根據采摘時間的不同分為L1采收期(5月20日采摘)、L2采收期(6月20日采摘)、L3采收期(7月22日采摘)、L4采收期(8月23日采摘)，樣品編號分別為L1、L2、L3和L4。

1.2.2 頂空萃取條件

頂空進樣體積：100 μL；孵育時間：15 min；孵育溫度：40 ℃；進樣針溫度：45 ℃；孵化轉速：500 r/min。

1.2.3 GC-IMS技術分析條件

色譜柱類型：FS-SE-54-CB-1(15 m, ID:0.53 mm)，色譜柱柱溫60 ℃，載氣/漂移氣：高純氮氣(純度≥99.999%)，載氣流速：E1(漂移氣流速)為150 mL/min，E2(氣相載氣流速)為初始2 mL/min，2 min內保持不變，2 min后增至100 mL/min，保持100 mL/min直至分析結束。IMS內置放射源：β射線(氚，3H)；漂移電壓：5 kV，漂移管長度：98 mm，管內線性電壓500 V/cm，漂移管溫度45 ℃，漂移氣：高純氮氣(純度≥99.999%)，漂移氣流速150 mL/min，離子化模式：正離子。GC-IMS檢測分析時間：40 min。

1.2.4 GC-IMS技術檢測方法

每份樣品0.5 g，分別做3次平行試驗，置于20 mL頂空瓶中，使用加熱的進樣針抽取瓶內的頂空組分，通過Flavour Spec氣相色譜-離子遷移譜儀進行分析。

1.2.5 GC-IMS技術定性定量分析

1.2.5.1 定性分析

通過儀器內置NIST數據庫和IMS數據庫進行定性分析。利用Matlab R2014a進行主成分分析(principal component analysis， PCA)。揮發性物質的氣相色譜-離子遷移圖譜和指紋圖譜采用Reporter和Gallery插件程序繪制，標準曲線采用LAV分析軟件繪制，表格采用Excel制作。

1.2.5.2 定量分析

通過G.A.S公司開發的LAV分析軟件進行百里香樣品的定量分析。采用外標法對被分析物質繪制Boltzmann函數標準曲線，根據分析物標準對照品濃度反推該分析物在百里香樣品中的濃度，完成定量。定量方法：分別稱取適量標準對照品于棕色容量瓶中，配制1000 mg/L 的標準儲備液，于4 ℃保存。分別稱取適量標準儲備液，以70%乙醇水溶液(V/V)定容，配制濃度分別為0.54，5.37，10.75，21.50，42.99，85.99 mg/L 的標準工作溶液，于4 ℃保存，通過氣相色譜-離子遷移譜儀測定不同濃度標準對照品的離子峰強度，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 百里香揮發性成分定性分析

對百里香花、葉進行揮發性物質定性分析，共檢測出72種揮發性物質，以儀器內置的NIST氣相保留指數數據庫與IMS遷移時間數據庫資料共定性識別出36種揮發性成分，包括醇類8種、醛類6種、酮類6種、萜類及其衍生物6種、酯類5種、酸類3種和雜環類物質2種，結果見表1。

表1 百里香樣品揮發性成分的定性Table 1 The characterization of volatile components in Thymus vulgaris samples

2.2 百里香樣品的氣相色譜-離子遷移指紋圖譜

為了更直觀地表現百里香花、葉在不同采收時期揮發性物質種類及濃度差異的動態變化，對所有樣品揮發性成分中已定性組分繪制氣相色譜-離子遷移指紋圖譜，見圖1。可以看出每種樣品的完整揮發性有機物信息以及樣品之間揮發性有機物的差異。圖中每一行代表一個樣品中選取的全部信號峰(每個樣品3次平行)，圖中每一列代表同一揮發性有機物在不同樣品中的信號峰。其中，顏色代表物質的濃度，顏色越深表示濃度越大。

圖1 百里香已定性揮發性成分的氣相色譜-離子遷移指紋圖譜Fig.1 The GC-IMS of volatile components identified in Thymus vulgaris

對比全部樣品的指紋圖譜，由圖1可知，不同采收期百里香花朵、葉揮發性物質的種類基本相似，但一些揮發性物質的濃度差異明顯，且呈現一定變化規律。葉中的揮發性物質種類及濃度要普遍高于花朵中，而不同采收期的花朵之間以及葉之間的揮發性物質種類及濃度也存在較大差異。圖1中A區域所示的揮發性物質為百里香花朵、葉中普遍存在的物質，在不同的花朵及葉樣品中的濃度較為相近，沒有明顯的分布特征，主要是一些醇類、醛類以及少量酯類物質。而圖中B區域所示的揮發性物質則主要在百里香葉中分布，且其在葉樣品中的濃度普遍高于花朵中，比較典型的是一些萜類及其衍生物，如檸檬烯、芳樟醇、α-松油醇、γ-松油烯等。圖中C區域所示的揮發性物質則主要分布在百里香花朵中，其在花朵樣品中的濃度普遍高于葉中，主要涉及一些酮類物質，如環己酮、庚酮等。而2,3-丁二醇(已定性物質第4列)，見圖中虛線框，在百里香花朵、葉中雖均檢出，但其在F2(6月)采收花中的濃度明顯高于F1(5月)采收的花朵，考慮這些揮發性物質可以作為區分百里香不同器官及相同器官不同采收期的特征物質。

2.3 百里香揮發性成分PCA分析

選取百里香全部樣品中所有揮發性化合物的信號峰進行 PCA 分析，以檢測樣品間揮發性物質是否有顯著性差異，結果見圖 2。其中，PC1的貢獻率為48%，PC2的貢獻率為24%，二者累計貢獻率高達72%，這說明通過主成分分析能夠獲取表征樣品揮發性成分中的大部分信息。

圖2 全部樣品的PCA分析Fig.2 Principal component analysis of all samples

由圖2可以直觀看出樣品之間的特征差異，百里香花朵樣品和葉樣品之間的距離較遠，而花朵或者葉子樣品彼此之間的距離相對近一些，但是仍然可以明顯區分，這是因為花朵和葉的特征差異比較明顯，且單個樣品的重復性較好，可見，使用PCA分析可以準確區分百里香花朵和葉，也能夠區分不同采收期的花朵和葉，這與指紋圖譜的分析結果一致，這間接說明氣相色譜-離子遷移譜技術在百里香摻假、質量鑒別等方面具有很好的應用潛力。

2.4 百里香揮發性成分定量分析

氣相色譜-離子遷移譜技術除了可以對百里香樣品中的揮發性物質進行定性分析、差異鑒別以外，還可以利用LAV分析軟件對揮發性物質進行定量檢測。已有研究表明，百里香酚和香荊芥酚是百里香揮發油中的主要成分[11]，《歐洲藥典》中對百里香的同屬植物中二者的含量有明確規定，要求二者在揮發油中的總和要高于40%，我國百里香質量標準中還沒有對二者含量的具體要求，一些研究學者已建立了關于二者含量檢測的方法以完善百里香的質量把控[12]。然而，基于GC-IMS對二者的定量分析鮮有報道，因此，本研究采用GS-IMS技術對百里香中的百里香酚和香荊芥酚進行定量分析，以期為百里香的質量標準研究提供一定數據支撐。

百里香酚和香荊芥酚二者為同分異構體，由于分子結構原因很難形成多聚體，此外，由于儀器的分離條件如分離柱類型、溫度等因素所限，導致二者的峰重疊，無法分離，計算時只能通過二者的總峰強度計算二者總濃度。百里香酚GC-IMS標準曲線見圖3，回歸方程及檢出濃度范圍見表2。

圖3 百里香酚GC-IMS標準曲線Fig.3 GC-IMS standard curve of thymol

表2 百里香酚的回歸方程及檢出濃度范圍Table 2 The regression equations and detected concentration ranges of thymol

百里香樣品中百里香酚的GC-IMS檢出濃度見表3。

表3 樣品中百里香酚的GC-IMS檢出濃度Table 3 The concentration of thymol detected in Thymus vulgaris samples by GC-IMS

試驗結果表明，百里香酚在百里香葉中的含量普遍高于其在花朵中的含量。在百里香花朵的發育過程中百里香酚的含量變化相對較小，盛花期花朵(F2)中百里香酚的含量略高于初花期的花朵(F1)，而在百里香葉的生長過程中百里香酚的含量變化較為明顯，其中，5月份采摘的百里香葉(L1)中百里香酚含量最高，8月份采摘的百里香葉(L4)中百里香酚的含量最低。

裴香萍等[13]對山西榆社地區的百里香進行百里香酚含量檢測，得出榆社地區6月份百里香中百里香酚的含量最高，本試驗結論與之相似，推測可能是地域相近的原因所致。百里香花朵期較短，植株生長發育較快，本試驗基于GC-IMS技術對百里香的主要揮發性成分進行定量分析，進一步深入探究了百里香不同采收期揮發性成分百里香酚的量變規律，為百里香原材料適采期的確定提供了數據支撐和理論依據，即對于陜西榆林地區百里香中百里香酚的利用，應以百里香葉為主，且最適采收期應為百里香的生長前期，即每年的5月份左右。

3 結論

本研究運用GC-IMS技術對百里香花、葉中的揮發性有機物分別進行定性分析、差異鑒別及定量檢測。從百里香花、葉中共檢測出72種揮發性物質，定性識別出36種揮發性成分，宋述芹等[14]利用頂空固相微萃取結合氣質聯用技術分別從百里香花朵和葉中鑒定出24種和14種揮發性成分，可見采用GC-IMS技術對百里香揮發性物質種類的分析更為適宜。通過GC-IMS技術建立不同采收期百里香花、葉中揮發性有機物的指紋信息模型庫，為百里香加工原料適采期的確定提供了數據支撐及科學依據，也為快速、高效分析百里香中的揮發性化合物提供了一種新的可靠手段。