分子標記鑒定結合田間農藝性狀選擇培育水稻黑C173

王皓然， 李榮田， 馬騰旭， 劉長華，3

（1.黑龍江大學 生命科學學院 黑龍江省普通高等學校分子生物學重點實驗室，哈爾濱150080；2.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱150500；3.黑龍江大學 現代農業與生態環境學院，哈爾濱150080）

0 引 言

中國是世界上最大的水稻（Oryza sativa L.）生產國與消費國［1］。黑龍江省是我國最大的稻作區之一，所生產的稻米大部分進入國際及國內市場，寒區稻米以其綠色優質特征深受消費者青睞。黑龍江省第三積溫區是黑龍江省的水稻主產區，該區域具有肥沃的土地資源、清潔的灌溉用水及漫長而寒冷的冬季，水稻病蟲害少，稻米綠色指標高。但是，黑龍江省第三積溫區冷涼的溫度條件與水稻喜溫性構成了基本的矛盾，水稻生產受障礙性冷害威脅較大。黑龍江省第三積溫區水稻品種必須具有生育期合適及耐冷性強的特征［2］。水稻空育131耐冷性強、主莖葉片數11片左右、耐肥性中等、高產穩產，曾經是黑龍江省第三積溫區的主栽水稻品種，也是粳稻年種植面積的紀錄保持品種?？沼?31水稻生長量偏小、莖葉姿態直立程度差，限制了其產量的進一步提升。培育具有空育131水稻熟期、耐冷性及對肥力反應程度等基本特性的高產水稻新品種是十分必要的。水稻抽穗期（Heading date，Hd）是從出苗到抽穗所經歷的天數，抽穗期的長短決定了水稻品種在不同區域的適應能力和產量［3］。Hd2基因，即PRR37/Ghd7.1/DTH7，Hd2是一個同時控制水稻每穗粒數、株高和抽穗期3個性狀的主效QTL位點，定位在第7號染色體上［4］，也被稱為HD2-L710P類型。依據Hd2和hd2在T2129C的SNP，Hd2具有XcmI酶切位點（5′-CCANNNNNNNNNTGG-3′），而hd2相應的序列（5′-CTANNNNNNNNNTGG-3′）失去了XcmI酶切位點，開發了Hd2-Caps標記［5-6］。Hd4基因，即Ghd7，是一個同時控制水稻每穗粒數、株高和抽穗期3個性狀的主效QTL位點。依據Hd4和hd4在G157T的SNP類型，Hd4具有XhoI酶切位點（5′-CTCGAG-3′），而hd4相應的序列（5′-CTCTAG-3′）失去了XhoI酶切位點，開發了Hd4-Caps標記［7-8］。由以往研究可知，黑龍江省第一積溫區晚熟品種大多數具有Hd2和Hd4基因，第三積溫區早熟品種具有突變的hd2和hd4基因［9］。吉粳88是北方粳稻在育種水平上具有劃時代意義的品種，具有株型直立、抗倒伏、生物量大、豐產和出米率高等優良性狀，適于吉林省北部和黑龍江省南部地區種植［10］。推測吉粳88具有Hd2Hd2Hd4Hd4基因型。以空育131為父本，保留其早熟抽穗期基因（hd2hd2hd4hd4）及耐冷性強、對肥力的反應、高產穩產等基因及性狀。同時，利用吉粳88株型直立、抗倒伏、生物量大和豐產等優良農藝性狀，對空育131水稻的株型、株高和豐產性等性狀進行遺傳改良，培育適于黑龍江省第三積溫區、在少施化肥條件下豐產的水稻新品種，有利于黑龍江省水稻主產區“資源節約、環境友好”生產類型的建設及推廣。為此，配制了雜交組合吉粳88×空育131，對于雜交后代，在秧苗期利用功能性分子標記選擇早熟抽穗期基因，在本田期利用目測觀察選擇株型、粒型、抗倒伏及耐冷性等農藝性狀，培育適于黑龍江省第三積溫區、耐冷、在減肥栽培條件下高產穩產的水稻新品種黑C173。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水稻

吉粳88具有株型直立、抗倒伏、粒型圓粒及出米率高、高產等優良農藝性狀，主莖葉片數15片葉左右，可以在吉林省北部和黑龍江省南部稻區栽培。

空育131耐冷性強、對肥力反應程度中等、高產穩產、主莖葉片數11片葉，適應于黑龍江省第三積溫區種植。

以吉粳88為母本、空育131為父本配制雜交組合的各個分離世代，經過鑒定選擇形成的穩定品系（包括黑C173）。

1.1.2 分子標記

用于鑒定基因位點Hd2（hd2）和Hd4（hd4）的功能性分子標記如表1所示。Hd2-Caps是基因位點Hd2（hd2）的功能性分子標記，Hd2位點期望條帶84 bp，hd2位點期望條帶101 bp；Hd4-Caps是基因位點Hd4（hd4）的功能性分子標記，Hd4位點期望條帶84 bp，hd4位點期望條帶104 bp［11］。

表1 鑒定水稻Hd2（hd2）和Hd4（hd4）基因位點的功能性分子標記Table 1 Functional molecular markers for Hd2（hd2）and Hd4（hd4）genes

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實驗中所用的化學試劑和分子生物學試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻基因組DNA的提取和PCR及其產物的酶切標記

在水稻苗期采摘供試水稻葉片，依據CTAB法［12］提取水稻基因組DNA，將提取后的DNA存放于-20℃保存備用，具體實驗方法如表2所示。利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切的PCR產物進行檢測。

表2 PCR及酶切反應體系Table 2 PCR and enzyme digestion reaction system

1.2.2 水稻黑C173的培育過程

黑C173的培育過程如圖1所示，播種育苗階段各項農事操作同一般生產田。本田階段除了降低施用化肥水平外，其他生產措施與當地生產田相同，化肥施用水平為每667 m2施用純N 6.5 kg，N∶P2O5∶1∶0.5∶1，比生產田施用化肥水平降低20%～30%。水稻新品系培育階段的田間試驗在黑龍江大學呼蘭校區水稻試驗基地和海南省三亞市南濱國農場黑龍江大學水稻南繁基地進行，水稻新品系鑒定階段的田間試驗在黑龍江省農墾總公司建三江分公司七星農場農業科技園區進行。

圖1 培育水稻黑C173的工作流程Fig.1 Process of breeding for the rice HeiC173

1.2.3 吉粳88和空育131田間性狀比較

在黑龍江大學呼蘭校區水稻試驗基地進行田間試驗。吉粳88和空育131插秧栽培。試驗設計為隨機區選法，3次重復，小區為3行區，行長4 m，行距30 cm，株距12 cm，小區面積4.6 m2，單本插秧。抽穗期調查莖葉株型指標，株型指標包括株高、主莖劍葉與莖基角、主莖劍葉與莖張角、主莖劍葉與莖披垂角等性狀。室內考種包括穗粒數、穗長、穗實粒數、千粒重、長寬比和稻谷的結實率。各田間性狀每小區調查5株，以5株平均數代表小區值，以小區平均數進行方差分析和差異性比較。

1.2.4 候選品系田間性狀的鑒定

高爐煉鐵簡易生產流程如圖1所示。爐料經裝料設備送入高爐中，熱風由鼓風動力裝置從高爐下部的風口鼓入爐內，爐料中的焦炭和熱風中的氧氣發生燃燒反應，產生大量高溫還原性氣體，將爐料加熱并還原，期間有煤粉和焦爐煤氣作為輔助還原劑輸入高爐中。同時，鐵水從出鐵口放出，礦石中的脈石和熔劑結合形成爐渣，從渣口排出。產生過程中也會產生高爐煤氣、余熱、高爐灰等副產品。

水稻候選品系及其對照空育131種植在黑龍江省農墾總公司建三江分公司七星農場農業科技園區并進行田間性狀鑒定，試驗設為隨機取組法，3次重復，小區為8行區，行長5 m，行距30 cm，株距12 cm，每穴插3棵苗，小區面積12.0 m2。水稻生長發育期間，每個小區按對角線定點5穴，每穴選擇1個主莖標記葉位，直至孕穗期止。根據葉位結果即知主莖葉片數，5穴主莖葉片數平均值為小區的主莖葉片數。調查莖葉形態各指標同1.2.3。收獲期每小區取5株進行室內考種，考種性狀包括株高、穗數、穗粒數、穗實粒數、結實率、千粒重、粒長、粒寬和長寬比等，各性狀5株平均數為小區的數值。收獲期每小區按對角線選2點每點收割1 m2測產，稻谷用于室內分析精米率和食味值。食味值根據國家標準《糧油檢驗 稻谷、大米蒸煮食用品質感官評價方法》（GB/T 15682-2008）進行評分。以小區平均數進行方差分析，t測驗檢驗各候選品系與空育131的差異顯著性。選擇符合育種目標要求的水稻品系，即黑C173。

1.2.5 水稻黑C173耐冷性、稻瘟病抗性和抗倒性的鑒定

鑒定水稻黑C173的耐冷性、稻瘟病抗性和抗倒性，對照為空育131。

耐冷性鑒定：按照李霞等的方法［13］對黑C173及空育131水稻進行耐冷性鑒定。水稻盆栽，每個品種至少種10盆，每盆中單本插秧3株，水稻生長發育過程中每株保持3個莖蘗，待水稻發育到小孢子母細胞減數分裂期時，將5盆水稻置于溫室，另5盆水稻置于人工氣候箱之中進行低溫脅迫。在15℃脅迫5 d后，將受脅迫過的水稻置于溫室，直到水稻成熟。調查低溫脅迫和常溫條件下的水稻結實率，1盆為1個單位，重復5次。在本文中，品種耐冷性是以耐冷性結實率為指標，耐冷性結實率=常溫條件下結實率-低溫脅迫條件下結實率。差值大證明耐冷性弱，差值小證明耐冷性強。

倒伏指數鑒定：供試水稻種植在黑龍江省農墾總公司建三江分公司七星農場農業科技園區并進行大區示范。在水稻黑C173和空育131抽穗20 d左右時，根據文獻［14］的方法調查水稻材料基部第2節間的彎曲力矩、抗折力及倒伏指數。彎曲力矩=基部第2節間底部至穗頂的長度（cm）×基部第2節間底部到穗頂鮮重（g）?？拐哿y定，將帶有葉鞘的基部第2節間兩端橫亙在兩個支點上，保持水稻材料水平，在待測水稻節間中點處懸掛一個盤子，并向盤子中加入重物，直到水稻莖稈折斷時為止，此時盤子及重物的合計重量就是該節間莖稈的抗折力。倒伏指數=彎曲力矩×抗折力×100。每個水稻材料測量5次倒伏指數，取其平均值代表抗倒伏性。

抗稻瘟病性鑒定：根據農業行業標準《水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術規程》（NY/T2646-2014）對水稻黑C173和空育131進行抗稻瘟病性鑒定。供試水稻種植于稻瘟病鑒定圃，多施氮肥，周邊種植感病品種蒙古稻。田間實驗設計采用隨機取組法，3次重復，小區4行區，行長4 m，行距30 cm，株行12 m，每穴插3顆苗，小區面積4.8 m2。在水稻分蘗期和孕穗初期時接種當地混合稻瘟病菌，孢子濃度為2×105個·mL-1，每個小區調查水稻葉瘟及穗頸瘟級別。一個小區調查5株，5株平均值為小區數值。

2 結果與分析

2.1 培育水稻黑C173的選擇體系

分子標記Hd2-Caps和Hd4-Caps對水稻空育131與吉粳88的PCR檢測結果如圖2所示。圖2顯示Hd2-Caps和Hd4-Caps在吉粳88和空育131水稻之間有明顯的多態性，吉粳88具有Hd2Hd2Hd4Hd4基因型，空育131具有hd2hd2hd4hd4基因型。這表明，在吉粳88×空育131的后代中，可以利用Hd2-Caps和Hd4-Caps分子標記鑒定選擇抽穗期基因位點Hd2（hd2）和Hd4（hd4）。

圖2 水稻抽穗期基因Hd2（hd2）和Hd4（hd4）分子標記在吉粳88和空育131間的多態性Fig.2 Polymorphism of Hd2（hd2）and Hd4（hd4）of rice heading date genes between Jijing88 and Kongyu131

2.1.2 田間觀察選擇體系

水稻吉粳88和空育131田間性狀表現如表3所示。由表3可知，空育131和吉粳88水稻之間在株高、主莖劍葉與莖基角、主莖劍葉與莖張角、穗粒數、穗長、穗實粒數、千粒重和結實率等性狀存在著極顯著差異。與吉粳88相比較，空育131株高較矮，莖葉直立性差，穗子偏小，結實性好。通過雜交育種措施保留空育131的早熟、耐冷和結實好等優良基因及性狀的同時，引進吉粳88莖葉直立和生長量大等特征，培育適應于黑龍江省第三積溫區的早熟、耐冷、穩產及比空育131更加豐產的水稻品種。

表3 水稻吉粳88和空育131的田間性狀差異Table 3 Difference of rice agconomic traits between Jijing88 and Kongyu131

2.2 水稻黑C173品系的培育

2.2.1 F1世代植株鑒定選擇

吉粳88為母本、空育131為父本進行雜交得到F1代，利用分子標記Hd2-Caps對F1代植株進行鑒定。在10個F1代植株中，第2～9號植株的基因型為雜合帶型，是真雜種；第1號和第10號植株表現為吉粳88帶型，是偽雜種，予以剔除，如圖3所示。收獲真雜種種子形成F2世代。

圖3 水稻吉粳88×空育131 F1代的植株Hd2（hd2）表型及基因型Fig.3 Phenotypes and genotypes in rice Hd2（hd2）genes of F1 plants of Jijing88×Kongyu131

2.2.2 自交世代植株的鑒定選擇

F2世代。F2世代種子育苗，選擇健壯的秧苗至少107株。分子檢測水稻秧苗Hd2-Caps和Hd4-Caps基因型。按照具有hd2和hd4基因的原則進行選擇，入選秧苗的基因型及數量如表4所示。入選秧苗移植到本田，田間按莖葉株型直立、結實好、株高高于空育131及生長健壯的原則初選及決選植株。F2世代決選的植株收獲形成F3世代株系，對F3世代株系編號，如表4所示。

表4 培育黑C173水稻F2代的分子標記及田間性狀的鑒定選擇Table 4 Dentification and selection of F2 plants of HeiC173 with molecular markers and field agronomic traits

F3世代。入選的F3世代5個株系，以株系為單位育苗。分子標記Hd2-Caps和Hd4-Caps檢測水稻秧苗基因型，每個株系檢測17株。依據同時具有hd2和hd4基因的原則選擇水稻秧苗，移植至本田，如表5所示。本田階段田間肉眼觀察農藝性狀，依據耐冷性、莖葉直立、劍葉夾角小、株高較高及抗稻瘟病，并且Hd2（hd2）和Hd4（hd4）位點目標基因盡量純合的原則，每個株系決選1株收獲種子，獲得F4世代。

表5 培育黑C173水稻F3世代株系的分子標記及田間性狀的鑒定選擇Table 5 Dentification and selection of F3 lines and plants of HeiC173 with molecular markers and field agronomic traits

F4世代。與F3世代工作類似，在F4世代各株系苗期檢測水稻植株Hd2-Caps和Hd4-Caps基因型，每個株系檢測17株。從被檢測植株中選擇同時具有hd2和hd4基因的植株移植到本田。本田階段肉眼觀測水稻植株耐冷、葉直立、劍葉夾角小和抗稻瘟病等農藝性狀。依據hd2hd2和hd4hd4位點目標基因型純合優先的原則，從分子鑒定入選并肉眼觀測選擇的群體中，每個株系選1株收獲種子，形成F5世代，具體如表6所示。由表6可知，F4世代決選株的分子鑒定位點基因型為hd2hd2hd4hd4。

表6 培育黑C173水稻F4世代株系的分子標記及田間性狀的鑒定選擇Table 6 Dentification and selection of F4 lines and plants of HeiC173 with molecular markers and field agronomic traits

F5世代。F5世代秧苗期各株系隨機選擇5株提取DNA，將株系內各株DNA等量混合形成混合DNA，以株系混合DNA為模板PCR檢測Hd2-Caps和Hd4-Caps的表型及基因型，如圖4所示。圖4顯示F5世代5個株系均為hd2hd2hd4hd4純系。F5世代每個株系本田插秧17株，形成株行。本田階段肉眼觀測水稻株行及植株，選擇耐冷、葉直立、株高較高、劍葉夾角小、抗稻瘟病的株系及植株，每個株系選1株收獲種子，形成F6世代。

圖4 分子檢測水稻吉粳88×空育131 F5世代株系Hd2（hd2）和Hd4（hd4）基因型Fig.4 Genotypes of Hd2（hd2）and Hd4（hd4）of F5 lines and plants of Jijing88×Kongyu131 with the molecular markers

F6及其以后世代。F6世代株系為單位育苗移栽，本田階段每個株系不少于17株。本田階段田間選擇耐冷、葉直立、莖葉夾角小、株高較高及抗稻瘟病植株，每個株系決選1株，收獲種子形成F7世代株系。F7及以后世代重復F6世代工作，直至形成穩定一致的株系世代為止。收獲穩定的株系，形成黑C173候選品系，即品系-1、品系-2、品系-3、品系-4和品系-5。

2.3 黑C173候選品系田間表現

水稻黑C173候選品系田間表現如表7所示。由表7可知，與空育131比較，水稻黑C173各候選品系的主莖葉片數、結實率、精米率和食味值等未見顯著差異；株高變高、莖葉姿態直立、穗粒數增多、穗子變大、豐產性極顯著地提高。其中，候選品系-1各性狀綜合表現最好，選擇品系-1并命名為黑C173。

表7 水稻黑C173候選品系田間性狀表現Table 7 Field characteristics of candidate lines of rice HeiC173

2.4 水稻黑C173的耐冷性、抗倒伏性和抗稻瘟病性

水稻黑C173的耐冷性、抗倒伏性和抗稻瘟病性的鑒定結果如圖5所示。由圖5可知，空育131和黑C173低溫脅迫后的結實率下降幅度未見顯著差異，空育131抗倒伏指數顯著高于黑C173，空育131葉瘟及穗頸瘟發病級顯著高于黑C173，說明黑C173比空育131的抗倒伏性及抗稻瘟病性增強，耐冷性與空育131類似。黑C173有可能在黑龍江省第三積溫區推廣應用。

圖5 水稻黑C173的耐冷性、抗稻瘟病和抗倒伏性Fig.5 Cold tolerance，blast resistance and lodging resistance of rice HeiC173

3 討 論

水稻Hd2（hd2）和Hd4（hd4）的基因位點是控制抽穗期的主效基因，利用功能性分子標記選擇Hd2（hd2）和Hd4（hd4）基因是有效的。周文甲等（2017）以黑龍江省第二積溫區水稻品種“綏粳14”為材料，利用CRISPR×Cas9技術對抽穗期基因Hd2進行基因編輯，使Hd2基因突變為hd2，創造了早熟香味水稻綏粳14-d1和綏粳14-d2［15］。薛為亞等以汕優63（珍汕97×明恢63）衍生的F2群體為材料研究雜種優勢的遺傳基礎時發現，Hd4基因的自然變異是調控水稻抽穗期和產量潛力的重要因素［16］。本文利用功能性分子標記選擇hd2和hd4基因，培育出了水稻黑C173。水稻黑C173具有hd2hd2hd4hd4基因型，植株主莖葉片數11片左右，比吉粳88少3片以上，適用于在黑龍江省第三積溫區種植。

株型、株高、抗倒伏和耐冷等性狀是水稻重要的農藝性狀，遺傳基礎復雜，目前利用分子標記進行這些重要農藝性狀的鑒定選擇尚有難度。田間目測觀察選擇莖葉姿態、株高、成熟期莖稈基部耐壓能力及分蘗穗和弱勢穎花的結實性等特征是可行及有效的。張洪熙等利用田間選擇方法在長江中下游稻區培育成功了秈型水稻理想株型材料。韓思迪等依據田間目測觀察結合分子標記檢測，選擇了水稻T135的理想株高性狀［17］。王笑見等利用分子標記結合田間農藝性狀鑒定選擇，創建了一批抗倒伏、抗稻瘟病或褐飛虱的恢復系［18］。本文利用田間目測觀察選擇株型、株高、抗倒伏和耐冷等性狀，培育出了株型直立、株高較高、抗倒伏和耐冷的水稻品種黑C173。

利用分子標記與田間觀察相結合鑒定選擇育種材料，是創制水稻新種質和培育水稻新品種的有效方法。裘燁等利用分子標記輔助選擇技術選擇抗稻瘟病基因，同時，田間進行農藝性狀的鑒定選擇，獲得了抗病、農藝性狀優良的水稻恢復系［19］。劉之熙等利用dCAPS標記結合目測觀察水稻田間的結實情況，選擇到水稻孕穗期耐冷基因S13316A［20］。dCAPS功能性分子標記技術結合田間選擇已經在番茄、大麥、大豆和水稻等植物中廣泛應用［21-22］。本文在秧苗階段利用功能性分子標記Hd2-Caps和Hd4-Caps等對水稻基因位點Hd2（hd2）和Hd4（hd4）進行了有效的選擇，縮小了本田階段育種材料群體，為本田階段準確鑒定水稻株型、株高、抗倒伏及耐冷性等農藝性狀提供了前提。分子標記與田間觀察相結合培育的水稻黑C173適于在黑龍江省第三積溫區種植，具有抽穗期早、莖葉直立、株高較高、抗倒伏、耐冷和豐產等目標性狀。

4 結 論

Hd2（hd2）和Hd4（hd4）位點是決定黑龍江省水稻抽穗期的主效基因，Hd2-Caps和Hd4-Caps標記可以有效地鑒定選擇Hd2（hd2）和Hd4（hd4）基因。結合田間目測觀察莖葉姿態、株高以及以手觸摸莖稈基部判斷耐壓能力強弱等，來選擇株型、株高、抗倒伏等農藝性狀是可行及有效的。在水稻秧苗階段，利用功能性分子標記選擇目標基因及性狀，縮小了本田階段育種材料規模，保證了田間目測觀察農藝性狀的準確性。利用分子標記和田間農藝性狀選擇相結合的方法，培育出的黑C173水稻品種具有hd2hd2hd4hd4基因型及早熟、莖葉直立、抗倒伏、豐產、出米率高和耐冷性好等特性，可以用于黑龍江第三積溫區優良稻米生產。