水產(chǎn)品中過敏原精氨酸激酶研究進展

程青麗，劉文穎，趙曉涵，谷瑞增，李國明*，魯軍*

中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心（北京 100015）

食品是人類很直接、很重要的消費品。食品安全直接關(guān)系著人民群眾的身體健康和生活質(zhì)量，關(guān)系著經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定，已成為世界性關(guān)注的問題[1]，食品過敏引發(fā)的疾病也逐漸成為人們關(guān)注的一個全球化公共安全問題。

隨著工業(yè)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們的食品種類和飲食習慣發(fā)生了翻天覆地的改變，因食物而導致過敏的人數(shù)也日趨增多，最終影響到人們的生活品質(zhì)和生命安全。據(jù)資料顯示，在全世界約有5%～8%的兒童和2%～3%的成人患有食物過敏疾病，其中90%以上的食物過敏原來自八大類食物，分別為花生、小麥、大豆、堅果類、牛奶、雞蛋、魚和甲殼類等[2]，另外還存在其他160種食物也可引起過敏反應。經(jīng)初步調(diào)查[3]，約有76%的過敏反應是由以上8種常見致敏食品引起的，其中對花生、大豆、小麥和堅果過敏的人數(shù)較少，其總和僅占自訴過敏總?cè)藬?shù)的6%。

食品在加工處理過程中還有可能產(chǎn)生新的過敏原，例如有人對魚類不過敏而對魚罐頭過敏，其原因可能是加工過程添加的食品添加劑成為新的過敏原。食品添加劑包括防腐劑、色素、抗氧化劑、香料、乳化劑、穩(wěn)定劑、松軟劑和保濕劑等，其中以人工色素、香料引起過敏反應較為常見。為了延長食品的貨架期、改善感官性狀和口感，這些化學物質(zhì)被廣泛用于各類食品中，但由于食品標簽中標注不明確或沒有標注，如果不特別注意往往難以覺察[4]。食物過敏是導致多種急性癥狀的重要原因，例如皮膚、腸道及呼吸道疾病等[5]。食物過敏的一般癥狀包括嘔吐、腹痛、腹瀉等，也包括皮膚反應及呼吸道癥狀，嚴重情況下甚至會出現(xiàn)系統(tǒng)性過敏性休克[6]。

一般引起人體過敏反應的水產(chǎn)品主要是有殼水生動物，其主要包括以蝦、蟹為代表的甲殼類動物和以貝類為主的軟體動物，其中蝦是最廣泛報道的水產(chǎn)過敏食物。近年來，國內(nèi)外的許多學者對甲殼類過敏原進行了大量研究，尤其是針對蝦中的主要過敏原36 kD原肌球蛋白（Tropomysin，TM）的研究最為透徹，現(xiàn)已證明原肌球蛋白是蝦中致敏性最強的過敏原[7]。研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸激酶（Arginine kinase，ATP：精氨酸N-磷酸轉(zhuǎn)移酶，EC 2.7.3.3）被鑒定為水產(chǎn)品甲殼類食物中的新型過敏原，精氨酸激酶是無脊椎動物體內(nèi)調(diào)節(jié)能量代謝最重要的酶之一，在無脊椎動物體內(nèi)能量產(chǎn)生較多時即機體催化精氨酸與ATP之間磷酸基團的可逆性交換，生成磷酸精氨酸和ADP兩種產(chǎn)物。在細胞活動爆發(fā)，需要能量的過程中磷酸精氨酸中的高能磷酸鍵在精氨酸激酶的作用下被轉(zhuǎn)移形成ATP。

1 水產(chǎn)品過敏

1.1 水產(chǎn)品過敏原

常見的水產(chǎn)品過敏原主要來自魚類、甲殼類和軟體類，其中魚類和甲殼類被FAO列入八大類過敏食物。不同的水產(chǎn)品其致敏原不相同，有的只含有一種，有的含有多種。迄今為止，已經(jīng)鑒定出6種甲殼類動物過敏原，包括原肌球蛋白（Tropomyosin）、精氨酸激酶，肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain）、肌鈣蛋C（Troponin C）、肌漿鈣結(jié)合蛋白（Sarcoplasmic calcium-binding protein）和磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triose phosphate isomerase），其中原肌球蛋白存在于章魚、扇貝等軟體動物及甲殼類肌原纖維中的主要過敏原，其空間結(jié)構(gòu)是兩個呈α螺旋的亞基相互纏繞成超螺旋結(jié)構(gòu)，具有很高的熱穩(wěn)定性，并且不同物種間的TM存在著免疫交叉反應[8-10]，TM是研究比較深入的甲殼類動物主要過敏原，而AK是存在于甲殼類動物中僅次于原肌球蛋白的另一重要過敏原，但是相關(guān)研究極少且不深入。AK可引發(fā)包括皮膚病態(tài)反應，消化道、呼吸道和心血管系統(tǒng)功能混亂等癥狀在內(nèi)的過敏反應，嚴重的甚至可能導致患者休克或死亡。

1.2 水產(chǎn)品過敏機制

作為日常食品中重要的一員，水產(chǎn)品因其具有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)且味道鮮美深受人們的喜愛。但隨著甲殼類水產(chǎn)品消費量的增多，越來越多人在享受鮮美水產(chǎn)品的同時卻也受到過敏問題的困擾，國內(nèi)有關(guān)調(diào)查顯示，有5%的兒童和2%的成年人會對某些水產(chǎn)品產(chǎn)生過敏。中國預防醫(yī)學科學院食品營養(yǎng)與安全中心的調(diào)查也表明，水產(chǎn)品是我國食品中最主要的過敏原[11]，并且其比例還在上漲。

水產(chǎn)品過敏大都是由IgE介導的免疫反應引起的即時型過敏[12]。陳紅兵等[13]表示，食物過敏引起的Ⅰ型變態(tài)反應包括食物過敏原的致敏階段、激發(fā)階段和效應階段。在致敏階段，機體接觸過敏性食物后，產(chǎn)生反應性IgE抗體。在嬰幼兒時期，由于胃腸道尚不健全，通透性高，食物中的過敏原進入到體液中，可以選擇性誘導抗原特異性B細胞產(chǎn)生IgE抗體應答，然后IgE抗體的Fc段與肥大細胞或嗜堿性粒細胞表面的IgE受體結(jié)合完成致敏過程。在正常狀態(tài)下的人群，對從呼吸道吸入和通過胃腸道攝入的過敏原可以產(chǎn)生免疫耐受。對于過敏體質(zhì)的人群，通過這些途徑進入的過敏原則可使機體處于致敏階段。在激發(fā)階段，相同的抗原再次進入機體時，通過與致敏肥大細胞/嗜堿性粒細胞表面IgE抗體特異性結(jié)合，使之脫顆粒，釋放出組胺、5-羥色胺、白三烯、前列腺素及嗜酸性粒細胞趨化因子等大量生物活性介質(zhì)，作用于效應組織和器官，引起局部或全身過敏反應。

2 精氨酸激酶的分子特性

2.1 精氨酸激酶的分子結(jié)構(gòu)

在無脊椎動物中，雖然不同來源的精氨酸激酶都可以催化精氨酸和三磷酸腺苷（ATP）的可逆反應，但是這些精氨酸激酶在分子結(jié)構(gòu)上卻有著很大的區(qū)別。根據(jù)精氨酸激酶的分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)，可分為：1）單亞基精氨酸激酶，是其存在的主要形式，如海灣對蝦（Penaeus aztecus），一般由約360個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量40 kDa左右；2）雙亞基精氨酸激酶，如海參（Stichopus japonicus），某些雙亞基精氨酸激酶的結(jié)構(gòu)與肌酸激酶相似，分子質(zhì)量約80 kDa；3）四亞基精氨酸激酶，如環(huán)節(jié)動物，其分子質(zhì)量約在150～160 kDa之間[14]。研究表明，精氨酸激酶由N端結(jié)構(gòu)域（1～111）和C端結(jié)構(gòu)域（112～357）組成。有兩個分別位于兩個結(jié)構(gòu)域中的高度保守的環(huán)，環(huán)63～68和環(huán)309～318。N端結(jié)構(gòu)域全為α螺旋，C端結(jié)構(gòu)域為7個α螺旋圍繞著的8股反向平行β折疊結(jié)構(gòu)[15-16]，研究表明精氨酸和磷酸精氨酸主要位于的N端結(jié)構(gòu)域，但是精氨酸激酶的活性部位位于C端末端[17]。

2.2 精氨酸激酶的活性位點

AK由一個較大的C端結(jié)構(gòu)域和一個較小N端結(jié)構(gòu)域組成，底物類似物結(jié)合形成的過渡態(tài)晶體結(jié)構(gòu)顯示，底物的結(jié)合位點是處在C結(jié)構(gòu)域的兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)之間。N端與C端兩個結(jié)構(gòu)域是通過其邊緣的氨基酸殘基相互作用結(jié)合在一起維持AK結(jié)構(gòu)及功能的完整性。

一般來說，精氨酸激酶的活性中心都具有（CPTNLGT）氨基酸殘基序列[18]。在太平洋牡蠣（Crassotrea gigas）中，精氨酸激酶中有高度保守的一對氨基酸殘基（D62和R193），它們形成一個離子對，將其替換掉會造成精氨酸激酶活性的大量喪失，其可能與調(diào)節(jié)底物與精氨酸激酶的結(jié)合有關(guān)[19-20]。

在海參的研究中，N-末端序列的缺失，將顯著影響精氨酸激酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和活性[21]。在雙亞基精氨酸激酶中，Trp-218位于精氨酸激酶的酶活性位點，將其突變?yōu)楸彼岷螅涿富罨締适АＭ瑫r發(fā)現(xiàn)，其對精氨酸激酶在構(gòu)象的穩(wěn)定方面發(fā)揮重要的作用。Trp-208沒有位于精氨酸激酶的酶活性位點，其可能有助于維持催化過程中二聚體構(gòu)象的穩(wěn)定性。將其突變?yōu)楸彼岷螅涿富钕陆抵猎瓉淼?0.3%，使酶易于受到熱變性的影響。此外，Trp-208可能也在蛋白正確折疊方面發(fā)揮重要的作用[22]。

3 精氨酸激酶致敏性

3.1 精氨酸激酶的免疫交叉反應

目前，國內(nèi)外研究主要集中在海洋魚、蝦、蟹的主要過敏原原肌球蛋白，對于精氨酸激酶的研究較少。AK是甲殼類動物中僅次于原肌球蛋白的又一重要過敏原，其分子質(zhì)量約為40 kDa。Yu等[23]在利用蛋白組學的方法評價斑節(jié)對蝦的致敏性時發(fā)現(xiàn)除原肌球蛋白外，另一個分子質(zhì)量為40 kDa，等電點為6.5的蛋白也具有很好的IgE結(jié)合活性，此后他們證實這個蛋白為AK，并且與其他物種的AK具有很好的序列相似性。Rahman等[24]發(fā)現(xiàn)大西洋雪蟹AK能夠與甲殼類過敏患者血清反應。Ayuso等[25]發(fā)現(xiàn)章魚AK同樣具有與甲殼類過敏患者血清的IgE結(jié)合活性，且章魚AK能夠明顯抑制蟹AK的IgE結(jié)合活性，因此證實AK在軟體類動物和甲殼類動物中存在交叉反應。Liu等[26]通過BALb/c小鼠建立了擬穴青蟹AK的動物過敏模型，證明了AK對小鼠具有較強的致敏性。此外凡納濱對蝦和擬穴青蟹等物種中的AK也先后被鑒定為重要過敏原[27-28]，AK已被證實是存在于甲殼類動物中的泛過敏原。

孫一帆等[29]通過制備抗凡納濱對蝦過敏原精氨酸激酶的多克隆抗體，并與17種常見有殼水生動物粗提液進行Western blotting，以分析該過敏原的免疫交叉反應。試驗結(jié)果顯示，凡納濱對蝦40 kD過敏原為精氨酸激酶；其氨基酸序列同源性分析顯示AK在蝦類（96%～100%）、蟹類（91%～93%）、貝類（49%～52%）、蟑螂（83%）中具有很高的同源性；Westerm botting結(jié)果顯示抗AK多抗與17種不同蝦類、蟹類、貝類的AK均能發(fā)生反應。結(jié)論：精氨酸激酶在甲殼類動物、軟體動物甚至昆蟲中具有高度保守性，且能引起強免疫交叉反應，是有殼水生動物中的一種泛過敏原。

3.2 外源物質(zhì)對精氨酸激酶的影響

過量的天冬氨酸會誘導精氨酸激酶的去折疊，導致結(jié)構(gòu)變化，活性喪失，但是這種失活隨著天冬氨酸濃度的降低而復性，同時，氯化鉀可使天冬氨酸誘導去折疊的精氨酸激酶變成溶態(tài)的球狀蛋白質(zhì)分子[30]。

在過氧化物的壓力下，與對照組相比，處理過的克氏錐蟲精氨酸激酶的表達量有了明顯地提高。這些發(fā)現(xiàn)證明精氨酸激酶參加了抗氧化能力的反應。同理，在硫化物的壓力下，精氨酸激酶的活性顯著升高[31]。劉陶陶等[32]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的Cu2+對于精氨酸激酶活力影響結(jié)果：二價銅離子對精氨酸激酶有明顯的活力抑制作用，而在同樣條件下同等濃度的Mg2+、Ca2+、Mn2+等二價金屬離子則不會使精氨酸激酶出現(xiàn)失活且進一步改變不同的銅離子濃度；監(jiān)測精氨酸激酶活力隨時間的變化過程，可以發(fā)現(xiàn)，精氨酸激酶在Cu2+作用下，隨著Cu2+濃度的升高，精氨酸激酶失活的速度也會加快。對于凡納濱對蝦的精氨酸激酶而言，低濃度的Na+、K+也表現(xiàn)出激活作用，這種作用隨著濃度的升高而消失，而Cu2+與Mn2+則表現(xiàn)出完全的抑制。對于龍蝦（H.Vulgarus）精氨酸激酶，Mn2+、Mg2+對催化反應有利，而Cu2+、Zn2+均不能參與此催化反應[33-34]。

由此可知，由于生長環(huán)境不同，不同物種其精氨酸激酶的外源促進物或抑制物有所不同。對于雙亞基AK，人們還研究了陰離子對催化其正向反應的影響，結(jié)果表明，NO3-、ClO4-、SCN-、Br-、Cl-和乙酸根對其所催化反應的抑制性依次降低[35]。

4 展望

我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)和消費大國，而一直以來因為食用這類食物而導致的過敏癥狀屢見不鮮，其發(fā)病率也逐步上升。隨著食品加工技術(shù)的不斷進步，人們開始關(guān)注如何通過加工的方式降低或是去除食物中過敏原的致敏性。當前應用于食物過敏原的加工脫敏方法主要有物理、化學、生物學方法，利用這些方法可破壞或修飾過敏原的抗原表位，改變過敏原抗原表位決定簇，從而達到降低食物過敏原性的目的。因此，明確蛋白的致敏表位及其變化規(guī)律是脫敏改性加工的研究基礎(chǔ)。

針對水產(chǎn)業(yè)，相關(guān)研究人員對水產(chǎn)過敏原開展了一系列研究。國內(nèi)外對水產(chǎn)主要過敏原原肌球蛋白研究比較透徹，對次于原肌球蛋白的精氨酸激酶的研究較少，到目前為止，國內(nèi)外對精氨酸激酶的過敏原表位信息研究并不深入。因此，下一步應以甲殼類水產(chǎn)品中重要過敏原精氨酸激酶為對象，通過蛋白質(zhì)組學、免疫組學、分子生物學等方法展開深入研究，闡釋AK的抗原表位與致敏機制，從根源上解決過敏問題，保障過敏患者的營養(yǎng)健康。