豬等孢球蟲純種株的建立及其生物學特性研究

程振揚 臧傳佼 徐向東 李文靜 候照峰 劉丹丹 許金俊 陶建平

摘要 從哺乳仔豬的腹瀉糞樣中分離出等孢球蟲卵囊，感染仔豬建立球蟲純種株。通過卵囊形態結構觀察與18S rRNA PCR鑒定，鑒定該球蟲分離株為豬等孢球蟲。將6只24日齡斷奶仔豬分為2組，分別感染4×102和104個孢子化卵囊，觀察仔豬的臨床表現及蟲株的潛伏期、顯露期和卵囊產量。結果表明，感染4×102個卵囊后仔豬未出現腹瀉癥狀，感染104個卵囊后仔豬出現腹瀉且持續6 d。感染4×102個孢子化卵囊時，潛隱期為5 d，顯露期為7 d，每個卵囊產出5.72×103個卵囊;感染104個孢子化卵囊時，潛隱期為5 d，顯露期18 d，每個卵囊產出6.41×102個卵囊。由此可見，該株豬等孢球蟲對仔豬具有致病性，可用于構建豬等孢球蟲病動物模型及其疾病學研究。

關鍵詞 仔豬;豬等孢球蟲;純種株;生物學特性

中圖分類號 S852.7文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）05-0095-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.026

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Establishment of Pure Strains of Isospora suis and Their Biological Characteristics Research

CHENG Zhen-yang， ZANG Chuan-jiao， XU Xiang-dong et al

（College of Veterinary Medicine / Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou University， Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract Oocysts of Isospora spp. were isolated from the feces of suckling piglets with diarrhea to infect piglet. A pure strain of Isospora spp.was established. Through the morphological observation of oocysts and PCR identification of 18S rRNA， the isolated strain was identified as Isospora suis.Six 24-day-old weaned piglets were divided into two groups randomly， and infected with 4×102 and 104 sporulated oocysts， respectively.Then the clinical manifestations， the prepatent and patent period， and oocyst output were observed. The results showed that no diarrhea symptom was observed in the piglets infected with 4×102 oocysts， diarrhea symptom was observed in the piglets infected with 104 oocysts and lasted for 6 days. After the piglets were infected with 4×102 sporulated oocysts，the prepatent and patent period were 5 and 7 days respectively， each oocyst produced 5.72×103 oocysts. After the piglets were infected with 104 oocysts， the prepatent and patent period were 5 and 18 days respectively，and each oocyst produced 6.41×102 oocysts. Therefore， this strain of Isospora suis had pathogenicity to piglets， and it could be used to establish the animal models of coccidiosis and the study of porcine coccidiosis.

Key words Piglet;Isospora suis;Pure strains;Biological characteristics

豬球蟲病主要是由等孢屬（Isospora）和艾美耳屬（Eimeria）的球蟲寄生于豬消化道引起的一種寄生性原蟲病[1]。據文獻記載，豬球蟲有16種，其中豬等孢球蟲（Isospora suis）致病力最強，是哺乳期仔豬球蟲病的主要病原，可引起仔豬食欲減少、嚴重腹瀉、消瘦等，其發病率高達80%，呈世界性分布，給養豬業造成巨大的經濟損失[2-4]。目前，該病的防治主要依賴于藥物[5]。在評價藥物對豬球蟲病的防治效果時，需要利用豬等孢球蟲感染仔豬，建立動物感染模型。因此，建立豬等孢球蟲蟲株及豬等孢球蟲病模型是評價藥物對豬球蟲病防治效果的基礎，也是進一步開展豬等孢球蟲生物學、疫苗學和疾病診斷的基礎。筆者通過卵囊分離、形態學觀察及PCR鑒定，建立了豬等孢球蟲的純種株，并通過人工感染仔豬試驗，研究豬等孢球蟲田間分離株的致病性及其排卵囊規律等。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

21日齡斷奶仔豬，體重5～7 kg，購自揚州某養豬場。試驗前，仔豬糞便用飽和糖鹽水漂浮法檢查有無球蟲卵囊，連續檢查3 d，同時觀察仔豬的精神狀態、食欲以及糞便形狀等。選擇體質健壯、糞檢球蟲卵囊呈陰性的仔豬用于試驗。仔豬飼養在經5%氨水和高錳酸鉀消毒2次的豬舍與籠子中，料槽、水槽、集糞盤等用具均用沸水沖洗消毒。仔豬定時喂食，自由飲水。

1.2 糞樣采集、卵囊分離與培養

揚州儀征市某豬場12日齡仔豬發生腹瀉，取新鮮腹瀉物置于塑料袋，放入低溫保存箱中運回實驗室。糞樣采用飽和鹽水漂浮法檢查，球蟲卵囊呈陽性者，其全部糞樣加入4～5倍清水及少量乙醚溶液后攪拌均勻，分別經60目和260目錦綸篩過濾，所得濾液經3 000 r/min離心8 min，棄上層液，往沉淀物中加入清水后攪拌均勻，3 000 r/min離心8 min，重復2次。往沉淀物中加入10倍體積的飽和糖鹽水（飽和食鹽水溶液與飽和蔗糖溶液的體積比為1∶1），攪拌均勻后3 000 r/min離心10 min，卵囊漂浮于液面。用膠頭滴管吸取上層漂浮物并置于20倍體積的清水中，3 000 r/min離心8 min，棄上清后加清水，攪拌均勻后再次離心（3 000 r/min，8 min）。重復3次。將沉淀物放入250 mL錐形瓶內，加入終濃度2.5%的重鉻酸鉀溶液，攪拌均勻后置于27 ℃恒溫培養箱中培養7 d。在培養過程中每天攪動培養液數次，同時用顯微鏡觀察球蟲卵囊孢子化情況。當90%卵囊完全孢子化時，收集卵囊置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3 純種卵囊的分離與增殖

參照戴亞斌等[6]的方法分離等孢球蟲卵囊，分別感染2頭仔豬，每頭感染100個孢子化卵囊。感染后第6～12天收集仔豬排出的全部糞便，按“1.2”方法分離卵囊并進行孢子化培養。

1.4 球蟲種類的形態學鑒定

取孢子化培養后的卵囊液制片，分別在10×40和 10×100倍的正置式生物顯微鏡下仔細觀察每個卵囊的形態與結構，測量卵囊和孢子囊的大小，對照參考文獻和圖譜進行種類鑒定[1，7]。

1.5 球蟲種類的PCR鑒定

1.5.1 球蟲卵囊純化與總DNA提取。

參照藏傳佼[2]的方法純化卵囊。將純化的卵囊經電動組織研磨器破碎后，參照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒操作指南提取卵囊總DNA。

1.5.2 豬等孢球蟲18S rRNA序列的PCR擴增。

參照藏傳佼[2 ]設計引物，由華大科技有限公司合成，引物序列如下：

18S-F為TGTTTATTAGATACAGAACCAACCCAC，18S-R為CTTTCTATGTCTGGACCTGGTGAG。

PCR反應體系（25 μL）如下：ddH 2O 9.5 μL，18S-F（10 μmol/L）和18S-R（10 μmol/L）各1.0 μL，Premix Taq 12.5 μL，DNA模板（135 ng/μL）1.0 μL。PCR反應條件如下：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物進行1.0% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。預期擴增片段長度為1 030 bp。同時，以剛第弓形蟲（Toxoplasma gondii）速殖子和豬艾美耳球蟲（Eimeria spp.）卵囊的DNA模板為對照，這2種DNA模板均由筆者所在實驗室提供。

1.6 人工感染試驗

1.6.1 試驗分組與感染。

將6只24日齡斷奶仔豬分成A、B 2組，每組3頭。A組為低劑量組，每頭感染4×102個孢子化卵囊;B組為高劑量組，每頭感染104個孢子化卵囊。借助于開口器與胃導管，將卵囊一次灌胃。

1.6.2 臨床觀察。

每天觀察3次并記錄仔豬的一般臨床體征，如飲食、精神狀態、糞便顏色與形狀等。每天清洗籠具、食槽和集糞板，防止繼發感染。

1.6.3 卵囊檢查。

感染后第4天開始用飽和糖鹽水漂浮法檢查糞便。每隔12 h檢查1次，發現卵囊后，每天收集仔豬全天排出的糞便，采用麥克馬斯特氏法[8]計算每克糞便中的卵囊數（oocyst per gram，OPG），然后計算出每天排出的卵囊總數，直至排卵囊結束，連續2 d糞檢未見卵囊則試驗結束。

2 結果與分析

2.1 球蟲卵囊形態學觀察結果

卵囊呈球形或亞球形，囊壁光滑且薄，無卵膜孔，平均大小為19.3（17.8～24.0）μm×17.6（14.7～21.9）μm。孢子化卵囊有2個孢子囊，無極粒與卵囊余體。孢子囊呈橢圓形或圓形，有呈顆粒狀的孢子囊余體，無斯氏體，平均大小為13.9（10.5～15.9）μm×10.4（7.6～11.8）μm。每個孢子囊內含有4個子孢子，子孢子呈臘腸形或香蕉形（圖1）。

2.2 純種卵囊分離與增殖結果

仔豬感染卵囊后第6天采用飽和糖鹽水漂浮法檢查其排出的糞便，發現少量卵囊。隨后收集至感染后第10天的全部糞便，用“1.2”的方法分離卵囊，培養至孢子化。顯微鏡下觀察收集的孢子化卵囊，可見卵囊大小較為一致，卵囊結構與“2.1”中描述一致，表明豬等孢球蟲純種株成功建立并得以增殖。

2.3 球蟲種類的PCR鑒定結果

以提取的卵囊DNA為模板，成功擴增出1 030 bp左右的條帶，與預期條帶大小相符。用剛第弓形蟲和豬艾美耳球蟲的DNA模板未擴增出條帶（圖2）。PCR鑒定結果進一步驗證此次建立的球蟲純種株為豬等孢球蟲。

2.4 臨床觀察

在整個試驗期間，全部仔豬精神、食欲、飲水均正常。A組（低劑量）仔豬排出的糞便外觀正常（圖3a），B組（高劑量）仔豬在感染后第6天排出灰土色的稀糞（圖3b），至第12天糞便形狀恢復正常。

2.5 卵囊產量、潛隱期與顯露期

豬等孢球蟲感染仔豬后的潛隱期、顯露期及其排卵囊規律見圖4。仔豬感染孢子化卵囊后第6天糞檢均可見卵囊，潛隱期為5 d。感染4×102個卵囊的仔豬第7天產出卵囊數達到高峰，每頭豬排出15.2×105個卵囊;隨后卵囊排出數迅速減少，第11天糞檢未見卵囊，其顯露期為5 d;每頭豬產出卵囊數共22.89×105個，每個卵囊產出5.72×103個卵囊。感染104個卵囊仔豬，感染后第8天排卵囊達到高峰，每頭豬排出20×105個卵囊;隨后卵囊排出數顯著減少，但在第12天和第19天排出卵囊數又略有增加，第23天糞檢未見卵囊，其顯露期為17 d;每頭豬產出卵囊數共64.10×105個，每個卵囊產出6.41×102個卵囊。

3 討論

迄今為止，文獻記載的豬球蟲有16種，在分類上隸屬艾美耳科（Eimeriidae）艾美耳屬和等孢屬，在等孢屬僅有豬等孢球蟲一個種[1-2]。艾美耳屬球蟲孢子化卵囊有4個孢子囊，每個孢子囊中有2個子孢子;等孢屬球蟲孢子化卵囊有2個孢子囊，每個孢子囊中有4個子孢子[1]。因此，依據孢子化卵囊的形態結構易于鑒別豬等孢球蟲。豬等孢球蟲對哺乳仔豬有易感性，主要引起仔豬腹瀉。該研究采集腹瀉仔豬的糞便進行糞檢，在腹瀉物中可見呈球形或亞球形的卵囊，卵囊孢子化培養后見其含2個孢子囊，每個孢子囊中有4個子孢子。隨后分離純種卵囊并用其感染仔豬、增殖卵囊，對增殖后的卵囊進行PCR鑒定，進一步鑒定該株球蟲為豬等孢球蟲。

豬人工感染試驗顯示，該豬等孢球蟲純種株的潛隱期為5 d，顯露期分別為5 d（感染4×102個卵囊）和17 d（感染104個卵囊），其顯露期隨感染劑量的增加而顯著延長。藏傳佼[2]報道24日齡斷奶仔豬感染 4×102個孢子化卵囊時，潛隱期為5 d，顯露期為7 d;感染104個孢子化卵囊時，潛隱期為5 d，顯露期達18 d。劉光輝等[9]報道3日齡仔豬感染30個豬等孢球蟲孢子化卵囊的潛隱期為7～9 d，顯露期為15～18 d;感染2 000個豬等孢球蟲孢子化卵囊的潛隱期為4～6 d，顯露期為7～13 d。究其原因，可能與感染豬的日齡、蟲株以及感染劑量有關。該試驗結果也顯示，豬排出的卵囊總量隨感染劑量的增加而增加，但每個卵囊的產卵囊數則有所下降，這與汪飛燕等[10]的報道相一致，可能是因“擁擠”效應所致。

豬等孢球蟲對不同日齡的豬均有易感性，3周齡內的哺乳仔豬感染后可引發疾病，主要臨床癥狀為腹瀉，病豬衰弱、脫水、發育遲緩，成年豬多為帶蟲者[11]。用于該試驗的豬是24日齡斷奶仔豬，感染4×102個卵囊后未出現腹瀉癥狀，感染104個卵囊后出現腹瀉且持續6 d，表明該豬等孢球蟲蟲株對仔豬具有致病性，可用于構建豬等孢球蟲病動物模型，同時也暗示保育豬和育肥豬在感染大量豬等孢球蟲時也會引發疾病。筆者發現哺乳仔豬糞便中含有大量的脂肪，用常規方法分離與收集豬等孢球蟲卵囊較為困難，而斷奶仔豬糞便中脂肪含量低、且粗纖維含量較高，卵囊分離較容易且孢子化率高。因此，筆者建議在進行豬等孢球蟲卵囊傳代增殖時，可選擇斷奶仔豬作為試驗動物。

參考文獻

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