微生物菌劑拌土對玉米農田土壤細菌群落多樣性的影響

沙月霞 王晨曦 邢敏 王佳娟 李明洋 沈瑞清

摘要 為明確微生物菌劑拌土對玉米農田土壤細菌群落多樣性的影響。對玉米農田土壤細菌的總DNA提取后，采用微生物多樣性測序技術對玉米農田土壤細菌的16S rRNA基因進行了序列測定，分析了2種微生物菌劑拌土后玉米農田土壤細菌群落多樣性和結構特征。微生物菌劑M1和M2拌土增加玉米農田土壤中全磷、硝態氮、有效磷和速效鉀的含量;對玉米土壤細菌群落多樣性有一定程度的影響，豐富度增加，多樣性和均勻度降低，檢測樣本序列數量和細菌群落的OTU （operational taxonomic units）數量顯著增加;對土壤細菌群落組成有影響，變形菌門（Proteobacteria）的豐度下降，放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的豐度增加，優勢菌屬放線菌和芽孢桿菌的豐度增加;降低了土壤中引起人類疾病、參與細胞轉化的微生物豐度，增加了參與代謝通路的微生物豐度。微生物菌劑拌土會影響玉米農田土壤細菌群落多樣性和結構組成，改善土壤營養，增加有益微生物的豐度，進而改善玉米農田生態環境。

關鍵詞 多樣性;土壤細菌群落;微生物菌劑;高通量測序;微生物生態學

中圖分類號 S 154.3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）05-0138-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.039

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effect of Clay Treated by Microbial Agents on Soil Bacterial Community Diversity of Maize Field

SHA Yue-xia1，WANG Chen-xi2，XING Min1 et al

（1. Institute of Plant Protection，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan，Ningxia 750011;2. School of Life Science，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750004）

Abstract To understand the microbial diversity of soil bacterial community of maize field treated by microbial agents on clay.High-throughput sequencing technology was adopted to study the microbial community structure and composition of soil bacteria in maize field.DNA of the microbial community of soil bacteria in the maize field was extracted. The bacterial 16S rRNA gene hypervariable region V5-V7 was detected by high-through sequenceing technologies.The contents of soil physicochemical indexes including total phosphorus，nitrate nitrogen，available phosphorus，rapidly available potassium was increased after maize field treated by microbial M1 and M2 on clay，respectively.In addition，the soil bacterial community diversity of maize field was influenced in some random，richness index was higher，diverse and evenness index were lower，and sequence and operational taxonomic units number of samples were increased. The abundance of Proteobacteria was reduced，and the abundance of Actinobacteria and Firmicutes were increased. Whats more，the abundance of the dominant bacteria genus containing Actinomycetes and Bacillus were improved evidently. The abundance of soil bacteria which could cause human disease and participate cell transformation was reduced，and that of soil bacteria participating metabolic pathway was higher. The soil bacterial community diversity and structure could be influenced after maize field treated by microbial agents on clay，in addition to enhance soil nutrition，increase abundance of beneficial microorganism，and then improve the ecological environment of maize field.

Key words Diversity;Soil bacterial community;Microbial agent;High-throughput sequencing technology;Microbial ecology

土壤微生物參與土壤物質循環和能量流動，是土壤有機物質的重要分解者和對農田土壤生態環境至關重要的生物活性因子，對環境影響非常敏感[1]。土壤微生物群落是土壤生態系統的重要組成部分，是衡量和評價土壤質量的指標之一[2-3]。土壤微生物群落多樣性、豐富度與均勻度可以保證土壤生態環境的穩定性，提高土壤抵抗環境惡化的緩沖能力[4-5]。開展黃河灌區土壤微生物群落多樣性和結構研究，對于實現黃河流域生態系統可持續發展具有重要的生態意義。

玉米是重要的糧食作物、飼料作物和工業原料，由于種植模式、氣候變化、化學肥料與農藥、土壤鹽漬化以及干旱等因素的影響，玉米農田土壤中病原菌的數量日積月累，土傳病害的危害日益加重[6-7]。土壤微生物中病原菌的數量和活性對農業生產中的農藝措施或者生物制劑的投入響應敏感[8-9]。微生物菌劑施用能夠改善土壤的營養狀況，提高土壤養分，還可以調節土壤微生物群落結構及多樣性[10]。Chen等[11]采用棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）顆粒劑在播種前與化肥混合施入土壤，對玉米莖腐病防效顯著。

馮帥[12]研究發現接種施氏假單孢菌（Pseudomonas stutzeri）A1501 能夠顯著影響玉米根際土壤細菌群落和固氮菌群落結構。程揚等[13]研究發現土壤中施加 5 t/hm2的秸稈生物炭對玉米根際和非根際土壤微生物群落結構和生態功能影響顯著，主要影響微生物群落代謝、遺傳和信息傳遞等過程。已有的研究主要集中于木霉菌、假單孢菌等對玉米田土壤細菌群落結構的影響，芽孢桿菌為功能菌的復合微生物菌劑對玉米農田土壤細菌群落多樣性的研究較少。該研究不僅探索了芽孢桿菌為功能菌的復合微生物菌劑拌土對玉米農田土壤細菌群落結構的影響，還探索了復合微生物菌劑對土壤營養的改善效果。筆者采用高通量測序技術，研究微生物菌劑拌土對寧夏玉米農田土壤細菌群落的物種組成、群落多樣性及結構的影響，為進一步探討土傳病害的防控與農田土壤的微生態功能研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地點是寧夏回族自治區石嘴山市惠農區廟臺鄉（106.70° E，39.20° N）。土壤類型為潮土，地下水位較高，鹽堿較重，有機質平均含量為（16.70±3.77） g/kg，有效磷平均含量為（26.70±17.30） mg/kg，速效鉀平均含量為（199.90±66.87） mg/kg。

1.2 試驗材料

①微生物菌劑M1，包括枯草芽孢桿菌（B. subtilis）HR15、萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）HR37和貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）HR55按照1∶1∶1比例的混合發酵液15 L、腐殖酸2.75 kg、硫酸鈣160 g[14]、硫酸鋅80 g[15]、硫酸亞鐵80 g、硫酸鉀80 g[16]，載體分別為羊糞30 kg。②微生物菌劑M2，將M1的載體更換為雞糞有機肥（包含有機碳25.5%、氮1.63%、磷1.54%、鉀0.85%）約30 kg。③微生物菌劑對照MCK，其功能菌是枯草芽孢桿菌和酵素菌BYM（由細菌、放線菌和真菌三大類30多種有益菌和生物酶組成的功能團），枯草芽孢桿菌≥1億個芽孢/g，酵菌素≥5億/g，由雷邦斯生物技術（北京）有限公司，載體是水溶性腐殖酸≥55%。④化學農藥對照是20%噁霉靈可濕性粉劑+生根粉，由深圳諾普信農化股份有限公司生產。玉米品種是濟玉901號。

1.3 微生物菌劑田間拌土的方法

2019年4月11日在寧夏回族自治區惠農區廟臺鄉東永固村種植玉米（未用過種衣劑），種植前將微生物菌劑M1、M2、微生物對照藥劑（MCK）均勻撒施在農田土壤表面，施用量為600 kg/hm2，20%噁霉靈可濕性粉劑+生根粉混合液（ES）均勻噴施到土壤表面，所有試驗小區均使用旋耕機旋耕，旋耕深度為20 cm左右。田間試驗設計5個處理：CK是空白對照;M1是載體為羊糞的微生物菌劑M1;M2是載體為雞糞有機肥的微生物菌劑M2;ES是化學農藥對照[20%噁霉靈可濕性粉劑+生根粉（4～6 g/m2）];MCK是微生物菌劑對照。每個試驗小區面積是200 m2，小區隨機排列，小區之間用田埂分隔，每個處理4個重復。試驗期間不施用其他殺菌劑，正常進行殺蟲劑、農藝措施和水肥管理。

1.4 微生物菌劑拌土對玉米農田土壤理化性質的影響

玉米乳熟期（7月22日）采用取土器（直徑為6 cm，長度為20 cm）采集農田土壤（距離植株15 cm，深度為0～20 cm），土壤樣本采用干冰帶回實驗室，一部分土壤樣品送上海美吉桑格生物醫藥有限公司檢測土壤微生物群落多樣性，另一部分土壤樣本檢測土壤pH、有機碳、有機質、全氮、全磷、硝態氮、有效磷、速效鉀等理化指標。

土壤樣品基本理化參數（全氮、全磷、pH 等） 采用常規方法測定：土壤pH采用ZLJC/YQ-025型pH計測定，全氮采用凱氏定氮法測定，有效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比法測定，全磷采用堿熔法測定，速效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法測定，土壤有機質采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定，土壤硝態氮采用紫外分光光度法測定。每個樣品3個重復，數據為平均值±標準誤。

1.5 基因組DNA抽提 提取各個處理的土壤樣本基因組總DNA，然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

1.6 PCR擴增

細菌擴增引物為338F：5′-barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，對細菌16S rRNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增，引物由上海美吉生物醫藥科技有限公司設計合成，測序區域合成帶有barcode的特異引物。PCR正式試驗采用20 μL反應體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，5.0 μmol/L正向引物0.8 μL，5.0 μmol/L反向引物0.8 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA10 ng，補ddH 2O至20 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 3 min;循環數×（95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s）;72 ℃ 10 min，10 ℃直到反應結束。第一輪擴增引物：799F-1392R 27cycles，退火55 ℃。第二輪擴增引物：799F-1193R 13 cycles，退火55 ℃。

對第二輪PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測。將PCR產物用QuantiFluorTM -ST藍色熒光定量系統（Promega公司）進行檢測定量，之后進行相應比例的混合。混合后的產物用Illumina公司的Miseq 2×300平臺測序。

1.7 數據處理與分析

高通量測序得到的原始數據進行質量控制和軟件拼接，過濾掉低質量的序列。將有效序列相似性≥97%序列聚類成為分類單元 （operational taxonomic units）。運用R軟件進行OUT分類等級的相對豐度統計，再用QIIME軟件進行單樣品組成分析，計算樣品的Coverage、Chao、Shannon指數等[14-16]。Shannoneven值數值越大，說明群落均勻度越低。Shannon值越大，說明群落多樣性越高。Coverage是覆蓋度指數，表征微生物樣本序列的檢測概率，數值越高表明檢測出的序列概率越高，能夠反映樣本中微生物的真實情況。Chao為豐富度指數，數值越大豐富度越高。利用QIIME和和Ggplot 2 軟件進行PCoA分析，ANOSIM中的statistic（R=-1～+1）越接近于1表示各處理組之間的差異大于組內的差異，如果R值比較小表示處理組之間和組內沒有差異。P值如果小于0.05，說明檢測值的可信度較高。通過Tax4Fun軟件對16S RNA基因序列進行基于Silva數據庫的KEGG功能注釋。

統計分析采用DPS 17.10軟件，顯著性分析采用單因素方差分析中的最小極差法（least significant ranges，LSD）（P≤0.05），數值為3次重復的平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 微生物菌劑拌土對玉米農田土壤理化性質的影響

微生物菌劑拌土對玉米農田土壤理化性質的影響見表1。由表1可知，與空白對照相比，4組處理均可以增加土壤中有機碳和有機質含量，對玉米農田土壤其他營養指標影響趨勢不一致。微生物菌劑M2可以增加土壤中全氮、全磷、硝態氮、有效磷和速效鉀的含量，微生物菌劑M1增加土壤中全磷、硝態氮、有效磷和速效鉀的含量，噁霉靈可濕性粉劑ES處理組降低土壤中硝態氮、全氮和速效鉀的含量，增加全磷和有效磷含量。

安徽農業科學2021年

2.2 檢測樣本序列統計 對5個處理的15個樣本進行了16S rRNA基因測序分析，原始數據經過拼接和過濾后得到797 948條優質序列。不同拌土處理獲得不同的序列數量，M2（59 237）>MCK（54 503）>M1（53 611）>CK（50 464）>ES（48 168）。一般將相似水平在97%的序列進行OTU聚類，統計所有樣本OTUs的豐度信息。檢測樣本優質序列的長度主要分布在401～440 bp，其中在401～420 bp序列數量最多為465 960條（圖1）。

2.3 玉米農田土壤細菌群落的共有和獨有OTU

Venn圖一般可以比較不同檢測樣本中共有和獨有的OTU數目。圖2顯示，5個處理樣本中的OTU數量不同，MCK（4 695）>M1（4 653）>M2（4 396）>ES（4 238）>CK（4 351）。不同處理組的土壤細菌群落中既有共有OTU物種，也有獨有的OTU。5個處理相同的OTU有2 701個，M1處理組獨有的OTU數量為266個，M2處理組獨有OTU數量為209個，MCK處理組獨有OTU數量為412個，CK處理組獨有OTU數量為208個，ES處理組獨有OTU數量為166個。除共有和獨有OTU外，各處理之間有相同或相似的OTU。

2.4 豐度等級曲線

Rank-Abundance曲線用以分析細菌群落的物種豐富度和均勻度，曲線的寬度反映了物種的豐富度，寬度范圍越大，豐富度就越高;曲線的形狀反映了群落均勻度，曲線越平緩，均勻度越高;曲線的下降趨勢反映了物種的多樣性，下降趨勢越平滑則物種多樣性越高，下降趨勢快速陡然表明物種的多樣性較低，群落中的優勢菌群所占比例較高。

圖3顯示，微生物菌劑M1和M2樣本的曲線跨度最大，且重合多，其他樣本的曲線跨度較小，說明M1和M2樣本的豐富度最高，而噁霉靈可濕性粉劑、微生物菌劑對照和空白對照樣本的豐富度較低。5組樣本的曲線形狀平緩、下降緩慢，表明5組處理的群落多樣性和均勻度都較高，其中空白對照CK的曲線下降相對劇烈，說明空白對照的群落多樣性和均勻度低于其他樣本。豐度等級曲線說明微生物菌劑拌土對土壤細菌群落的豐富度、多樣性和均勻度有影響。

2.5 微生物菌劑拌土對玉米農田土壤細菌群落多樣性的影響

2.5.1 Alpha多樣性。采用16S rRNA基因測序技術對玉米農田土壤細菌群落多樣性進行了分析，明確微生物菌劑拌土對玉米田土壤細菌群落多樣性的影響，微生物菌劑拌土對玉米農田土壤細菌群落多樣性的影響見表2。由表2可知，檢測樣本的覆蓋度均達98%以上，說明檢測結果基本反映了土壤樣本中細菌群落多樣性信息。各處理的土壤細菌群落豐富度指數有一定差異（P<0.05），M1>M2>CK≈MCK≈ES。微生物菌劑拌土后降低了土壤細菌群落多樣性，各處理之間有一定差異（P<0.05），CK>M1≈MCK≈ES>M2。微生物菌劑拌土對土壤細菌均勻度有一定影響（P<0.05），CK≈ES≈MCK>M1>M2。試驗結果證實，微生物菌劑拌土對玉米農田土壤細菌群落多樣性具有一定程度的影響。

2.5.2 Beta多樣性。采用主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA分析）比較不同處理微生物群落差異。土壤細菌群落PCoA（圖4）的前2個主坐標軸解釋了41.99%的群落差異，其中軸Ⅰ和軸Ⅱ分別是27.62%和14.37%，微生物菌劑對照MCK和M2分布在不同象限，與空白對照CK相距較遠，說明微生物對照菌劑和M2拌土會改變土壤細菌群落結構。微生物菌劑M1、噁霉靈可濕性粉劑（ES）處理組和空白對照的土壤細菌群落距離較近，說明這2組處理對玉米農田土壤細菌群落多樣性有一定程度的影響，但還可能存在其他影響因素。樣本分組相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）結果顯示，5組樣本之間的R值只有0.262 2，說明處理組間差異與組內差異之間沒有差異（P>0.05）。P值為0.015說明該檢測結果可信度比較高，能夠顯示組間和組內的差異。

2.6 微生物菌劑拌土對玉米農田土壤細菌群落結構組成的影響

2.6.1 門水平上的群落構成。圖5顯示玉米農田土壤中的細菌門主要包含變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chioroflexi）、 酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單孢菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）。拌土處理組樣本的放線菌門、酸桿菌門和厚壁菌門的相對豐度高于空白對照，其中微生物菌劑M1和M2的放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的豐度最高。空白對照樣本的變形菌門和芽單孢菌門相對豐度高于其他樣本，噁霉靈可濕性粉劑拌土的樣本中變形菌門的豐度最低，酸桿菌門的豐度最高。說明微生物菌劑拌土會影響玉米農田土壤細菌門水平上的群落組成。

2.6.2 屬水平上的群落構成。樣本測序結果中不能分類的細菌屬比例較大，圖6顯示玉米農田土壤中可以分類的相對豐度>1.0%的優勢細菌屬主要包括鞘氨醇單孢菌屬（Sphingomonas）、節桿菌屬（Arthrobacter）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、大理石雕菌屬（Marmoricola）、Gaiella和芽孢桿菌屬，其中節桿菌屬、類諾卡氏菌屬、大理石雕菌屬和Gaiella都屬于放線菌門，鞘氨醇單孢菌屬于變形菌門，芽孢桿菌屬于厚壁菌門。空白對照樣本的Gaiella豐度高于其他處理，但節桿菌屬、類諾卡氏菌屬、大理石雕菌屬和芽孢桿菌屬的相對豐度低于其他樣本。微生物菌劑M1和M2拌土處理的樣本中節桿菌屬、類諾卡氏菌屬、大理石雕菌屬、Gaiella和芽孢桿菌屬

的豐度高于其他樣本，M2樣本的鞘氨醇單孢菌屬豐度最高。噁霉靈可濕性粉劑樣本的鞘氨醇單孢菌屬豐度最低，節桿菌屬、類諾卡氏菌屬、大理石雕菌屬、Gaiella和芽孢桿菌屬的豐度低于M1和M2，但高于空白對照和MCK。說明微生物菌劑拌土會影響玉米農田土壤細菌屬水平上的群落構成。

2.7 玉米農田土壤細菌群落的Tax4Fun功能預測

KEGG數據庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes）用于系統分析檢測樣本的基因組信息和功能信息。表3表明，微生物菌劑拌土后，玉米農田土壤中參與各種代謝通路、細胞轉化、環境信息、有機系統以及引起人類疾病的微生物豐度發生了變化，但土壤中參與基因信息的微生物豐度沒有變化。微生物菌劑M1和M2拌土降低了土壤中引起人類疾病、細胞轉化的微生物豐度，提高了土壤中參與代謝通路的微生物豐度。Tax4Fun結果說明微生物菌劑拌土會影響玉米農田土壤微生物群落的基礎生命功能，從而改善了土壤的生態功能。

3 結論與討論

土壤微生物具有重要的生態功能，參與土壤中有機質的分解和腐殖質的合成，促進土壤養分的轉化和循環，提高土壤肥力[17]。土壤微生物的生物活性容易受到土壤理化性質、種植模式、植物種類等因素的影響[18-19]。土壤微生物群落的多樣性反映了土壤生態機制和逆境脅迫對微生物群落的影響，在一定程度上可用作土壤生態系統穩定性和土壤質量健康的評價指標[20]。目前，有關芽孢桿菌為功能菌的復合微生物菌劑拌土對黃河流域的玉米農田土壤微生物群落組成及其多樣性的影響尚未見報道。筆者首次采用高通量測序技術對微生物菌劑拌土后玉米農田土壤細菌群落及其多樣性進行了研究。微生物多樣性測序技術具有高通量、操作簡便、快速、數據精確、成本低等特點。筆者采用16S rRNA測序技術對微生物菌劑M1和M2拌土對寧夏玉米土壤細菌群落多樣性和結構特征的影響進行了研究，得出了噁霉靈可濕性粉劑、微生物菌劑對照、微生物菌劑M1和M2對玉米品種濟玉901土壤細菌群落豐富度、多樣性和均勻度以及所屬的門分類水平上的相對豐度。測序結果表明，檢測樣本的細菌群落在目、科和屬水平上仍有較大比例的微生物不能明確分類，但在門水平上獲得比較明確的分類名稱信息。估計與測序序列長度、測序區間、比對的數據庫以及16S rRNA基因本身的局限性等有關。

土壤pH與細菌群落多樣性具有顯著負相關性[18]，該研究證實微生物菌劑拌土處理組的土壤pH明顯降低，但土壤細菌群落多樣性明顯增加。細菌喜歡生活在營養豐富、有機質易于分解的土壤環境中[20]。芽孢桿菌可以將土壤中植物難以吸收的營養元素轉化為易吸收的營養物質，改善土壤的生態環境。該研究的2種復合微生物菌劑的功能菌是3種土壤來源的芽孢桿菌，拌土處理可以顯著增加土壤中有機碳、有機質、硝態氮、有效磷、速效鉀的含量，為土壤細菌的繁殖提供了豐富的營養環境，增加了細菌群落的物種豐富度和均勻度，提高了土壤生態系統的穩定性。因此，評價微生物菌劑對土壤微生物群落的影響具有重要的生態學意義。

土壤細菌群落在門水平上的組成主要包括變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、厚壁菌門等，外源投入物對土壤細菌門的豐度影響顯著。微生物菌劑M1和M2拌土后，玉米農田土壤細菌群落的變形菌門豐度下降，放線菌門的豐度增加，這與Chen等[11]、馮帥[12]、呂寧等[19]的研究結果較為一致。關于細菌屬水平的組成影響，該研究結果與前人的研究差異較大。采用微生物菌劑M1和M2拌土后，玉米農田土壤細菌群落中的優勢菌屬主要是放線菌屬和芽孢桿菌屬，顯著增加了土壤中有益微生物的豐度。土壤中病原菌的數量及其生物學活性的增加會破壞土壤微生物群落的穩定性與和諧性，從而危害地上部植物的正常生長[6-7] 。放線菌和芽孢桿菌可以產生多種抗菌活性物質和植物激素，可以抑制土壤中有害微生物的數量和危害，促進地上部植物生長，進而增強了土壤的生態服務功能[21]。

微生物群落多樣性是否穩定會直接影響微生物的生態功能和整個生態系統。該研究中的微生物菌劑拌土后，參與各種代謝的微生物豐度明顯增加，土壤中引起人類疾病的微生物豐度明顯降低;惡霉靈可濕性粉劑處理后的玉米土壤微生物群落結構穩定性較差，土壤中引起人類疾病的微生物豐度增加。研究結果證實微生物菌劑拌土可以改變土壤微生物基本生命活性功能和代謝途徑，從而改善土壤微生物對生態環境的調控效應，增強土壤的生態功能。

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