酪蛋白納米膠束的構建及其對藥物穩定性的影響

丁霽 陳沅芷 唐澤巖 王韜

【摘? 要】在目前，越來越多的天然活性小分子成為了臨床治療冠心病的候選藥物。然而這些天然藥物大多在水中難溶解，不穩定，這使得它們在臨床上的應用遭受到了巨大的限制。本項目主要探究的是：酪蛋白納米膠束的包藏對藥物丹參酮的穩態的影響。首先，我們利用酪蛋白的自組裝功能，將丹參酮（tanshinone）包藏于酪蛋白中形成納米膠束。在包封完成后，分別測量丹參酮-NaC復合物的包封率、表征、繪制紫外可見吸收光譜及抗菌活性研究。最后得出結論：丹參酮-NaC納米膠束復合物的構建顯著提高了丹參酮的穩定性，為將來藥物研究提供了新的方法和思路。

【關鍵詞】酪蛋白;丹參酮;納米膠束;藥物穩態;抑菌活性

Abstract：At present， more and more natural active small molecules have become the candidate drugs for clinical treatment of coronary heart disease. However， most of these natural drugs are insoluble and unstable in water， which limits their clinical application greatly. This project mainly explores the effects of casein nanomicelle encapsulation on tanshinone homeostasis. First， we used the self-assembly function of casein to encapsulate Tanshinone in casein to form nano-micelles. After the completion of encapsulation， the encapsulation rate and solubility of tanshinone-NAC complex were measured， and antibacterial activities were characterized and mapped. Finally， the conclusion was drawn that the construction of tanshinone -NaC nano-micellar complex significantly improved the stability of Tanshinone and provided new methods and ideas for future drug research.

Keywords： Casein; tanshinone; Micelle; Drug Stability; Bacteriostatic activity

1.緒論

1.1引文

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病，常常被稱為“冠心病”。冠心病主要是由于冠狀動脈出現多樣硬化引起的，它是一種終身性疾病，血管中的斑塊一旦形成，很難徹底的消除，我們只能夠通過長期用藥穩定病情。然而，持續服用目前治療冠心病的藥物會對肝、腎等器官產生明顯的危害，甚至還會引起頭疼、嘔吐的情況;但是一旦停止藥物，也將會引發非常嚴重的后果。

相比傳統的治療冠心病的藥物，越來越多的天然生物活性分子因其低毒性，被認為是作為治療冠心病的長期服用藥物，最有希望的候選者。丹參酮（Salvia miltiorrhiza Bunge） 是從中藥丹參（唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge根）中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，經臨床試用證明治療心絞痛效果顯著，副作用小，為一治療冠心病的新藥。丹參酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促進傷口愈合等多方面作用，長期服用未見有明顯副作用。但穩定性差，易受溫度、pH及溶劑影響，發生不同程度的解離，影響藥物效果。因此，開發新型有效的藥物包藏系統勢在必行。構建藥物包藏系統的目的是增強藥物的水溶性、穩定性，因此，藥物的良好的生物相容性，會逐步展現出在癌癥臨床治療中的巨大潛力。

酪蛋白是一種兩親性大分子共聚物，能夠發生自組裝成為一種優良的包埋材料，具有良好的穩定性并且能與小分子和離子相結合，能夠通過控制外部條件改變其結構和特性。酪蛋白膠粒的兩親性和自組裝特性有助于提高其穩定性。本項目探究酪蛋白納米膠束對藥物的穩態的影響，實驗從以下幾個方面開展工作：首先，利用酪蛋白自身的自組裝特性將丹參酮包藏于酪蛋白中，形成丹參酮-NaC納米膠束復合物并測量其包封率;其次，利用紫外分光光度計分別對游離的丹參酮、游離的酪蛋白及酪蛋白納米復合物進行表征，并繪制出相應的紫外可見吸收光譜圖;在包封完成后，測量納米復合物的最小抑菌濃度，探究其生物活性，期望為冠心病的臨床治療做出一定的貢獻。

1.2丹參酮

（1）理化性質。丹參酮，又名總丹參酮，是從中藥丹參（唇形科植物丹參根）中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，從中分得丹參酮I、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、異隱丹參酮等10余個丹參酮單體，其中隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅱ，羥基丹參酮、丹參酸甲酯、丹參酮ⅡB 5個單體。

（2）生理功能。隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅱ，羥基丹參酮、丹參酸甲酯、丹參酮ⅡB 5個單體具有抗菌作用，且有抗炎、降溫作用。丹參酮ⅡA的磺化產物丹參酮ⅡA磺酸鈉能溶于水，經臨床試用證明治療心絞痛效果顯著，副作用小，為一治療冠心病的新藥。丹參酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促進傷口愈合等多方面作用，長期服用未見有明顯副作用。

1.3酪蛋白

（1）理化性質。純酪蛋白為白色、無味、無臭的粒狀固體。相對密度約1.26。不溶于水和有機溶劑。酪蛋白為非結晶、非吸潮性物質，常溫下在水中可溶解0.8-1.2%，微溶于25℃水和有機溶劑，溶于稀堿和濃酸中，能吸收水分，當浸入水中則迅速膨脹，但分子不結合。

（2）酪蛋白納米膠束。酪蛋白是一種兩親性大分子共聚物，能夠發生自組裝成為一種優良的包埋材料，具有良好的穩定性并且能與小分子和離子相結合，能夠通過控制外部條件改變其結構和特性。其膠粒的兩親性和自組裝特性有助于提高其穩定性。

1.4本選題研究的意義及主要內容

本選題研究的意義是：天然化合物丹參酮具有多種生理功能，其中，丹參酮治療冠心病的效果和機制已經得到了廣泛的報道和應用。然而，它存在著水溶性差、遇光熱易分解、化學穩定度低、代謝快、半衰期短、難以被生物體吸收和利用等缺點。為了解決藥物傳遞過程中藥效降低和藥物釋放的難題，開發更加安全高效的藥物遞送系統迫在眉睫。

酪蛋白是一種兩親性大分子共聚物，能夠發生自組裝成為一種優良的包埋材料，具有良好的穩定性并且能與小分子和離子相結合，能夠通過控制外部條件改變其結構和特性。其膠粒的兩親性和自組裝特性有助于提高其穩定性。

本課題的主要內容是：選取酪蛋白酸鈉包藏丹參酮，探究酪蛋白納米膠束的包藏對藥物的穩態的影響。首先，利用酪蛋白的自組裝功能將丹參酮（tanshinone）包藏于酪蛋白中以形成納米膠束。包封完成后，分別測量丹參酮-NaC復合物的包封率、繪制紫外可見吸收光譜以及儲藏穩定性及抗菌活性研究。最后得出結論：丹參酮-NaC納米膠束復合物的構建顯著提高了丹參酮的儲存穩定性，為將來藥物研究提供了新的方法和思路。

2.納米復合物的制備

2.1實驗材料

丹參酮ⅡB、酪蛋白酸鈉、95%乙醇、磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鉀、胰蛋白胨、牛心浸出粉、氯化鈉、葡萄糖

2.2實驗儀器

電子天平、pH計、恒溫水浴鍋、磁力攪拌器、紫外分光光度計、紅外光譜儀、恒溫培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋

2.3實驗方法

（1）配制丹參酮溶液。①計算丹參酮粉末的質量：50mL*1mg/mL=0.05克。②用電子天平稱0.05克丹參酮于燒杯中，加少量95%乙醇溶解，然后倒入50毫升容量瓶里，分3次洗燒杯，將溶液全部倒入容量瓶里。③用95%乙醇稀釋至刻度線，搖勻，即可得到50ml濃度為1mg/ml的丹參酮溶液。

（2）配制酪蛋白酸鈉溶液。①分別計算酪蛋白酸鈉粉末的質量為：0.5g、0.4g、0.3g、0.2g、0.1g。②用電子天平分別稱取酪蛋白粉末于燒杯中，加少量水溶解，然后倒入50毫升容量瓶里，分3次洗燒杯，將溶液全部倒入容量瓶里。③用水稀釋至刻度線，搖勻，即可得到50ml的5個不同濃度的溶液。

（3）配置100ml，pH為7.4的PBS溶液。①用電子天平稱0.156克磷酸二氫鈉、0.35814g十二水合磷酸氫二鉀于燒杯中，加少量水溶解。②將其倒入100毫升容量瓶里，分3次洗燒杯，將溶液全部倒入容量瓶里。③用水稀釋至刻度線，搖勻，即可得到100ml濃度為1mg/ml的pH為7.4的PBS溶液。

（4）繪制酪蛋白酸鈉的標準曲線。①分別用乙醇配置濃度梯度為2、4、6、8、10 μg / mL 的酪蛋白酸鈉標準溶液。②用高效液相色譜 （HPLC， LC-20A） 檢測酪蛋白酸鈉標準溶液。③在word中分別輸入酪蛋白酸鈉溶液濃度及其對應的吸光度，做其對應的吸光度與酪蛋白酸鈉溶液濃度的趨勢線，并求其回歸方程。（色譜條件：流動相為乙腈：0.5 %乙酸水 （44：56）;檢測波長為428 nm;流速為1 mL / min;柱溫為35 ℃;進樣體積為20 μL。）

（5）用酪蛋白酸鈉包藏丹參酮。①將容量瓶中的PBS溶液與酪蛋白酸鈉溶液用量筒分別量取50ml至燒杯中，用移液槍移取5ml的丹參酮乙醇溶液于試管中。②將燒杯放在磁力攪拌器中央位置，調整轉速為600轉，邊攪拌邊滴加丹參酮乙醇溶液于燒杯中。③靜止燒杯于磁力攪拌器中央，攪拌2小時。

（6）測定丹參酮-酪蛋白酸鈉膠束的包藏率。①取上述包藏完畢的混合液于離心管中，將離心管放入離心機中離心1h。②取上清液，用紫外分光光度計測其吸光度三次并記錄。根據之前得出的酪蛋白酸鈉的標準曲線計算出丹參酮的包藏質量，計算出參酮-酪蛋白酸鈉膠束的包藏率。

（7）丹參酮溶解度的測定。①用去離子水配制500μg/mL的丹參酮-PBS混合液200mL。②將配制好的混合液于超聲波溶解儀中超聲20min以上，發現明顯未溶固體。③改用無水乙醇配制500μg/mL的丹參酮-乙醇溶液，超聲20min，未溶固體量減少。④用紫外分光光度計測上述丹參酮-乙醇溶液吸光度，確定其溶解情況。⑤其結果為0.161，數值較低。丹參酮在無水乙醇中溶解度較小，而在PBS溶液中明顯難溶，表明丹參酮溶解性較差。

（8）酪蛋白納米復合物的表征。采用紫外可見吸收光譜檢測0.05g/L的丹參酮溶液，1g/L的酪蛋白酸鈉溶液，和原先已配置的丹參酮-NaC復合物溶液的光譜特性。

（9）制備金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的菌懸液。①量取600ml水，按比例稱取牛肉粉3g、氯化鈉3g、蛋白胨6g，混合溶解，配得600ml培養液，分裝到六個錐形瓶中。②錐形瓶加棉塞，瓶口用報紙包裹，并用麻繩扎好，防止滅菌時冷凝水浸潤棉塞，用記號筆標記姓名日期。③檢查滅菌鍋水位險保證水位線高于最低水位。④將包好的三角燒瓶放入鍋中。蓋上鍋蓋，先擰緊蓋，后擰緊螺栓。⑤打開排氣閥并打開電源，設定溫度120度開始加熱，當鍋內水溫達到100度，等待幾分鐘。⑥滅菌時間到達后切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當壓力表壓力為零時，打開排氣閥，松開螺栓，打開蓋子，取出培養皿。⑦取已制好滅菌過的培養基和培養皿。拆開包培養皿的報紙，點燃酒精燈，進行無菌操作，掀開報紙，取下棉塞。另一手抓住培養基底部，培養基口對火焰。左手大拇指和食指撐住皿蓋。剩下三指托住皿底，在火焰旁打開皿蓋。將培養基液體緩緩倒入培養皿中，靜置，待其凝固后倒置。⑧待其凝固后，將金黃色葡萄球菌與大腸桿菌分別接種在牛肉膏蛋白胨平板上，保持37°C恒溫培養24h，活化后用10ml無菌水配置成菌懸液。

（10）用96孔板法測最小抑菌濃度。①在96孔培養板所有實驗孔中，分別加入空白肉湯100μL。②在96孔培養板第一排，分別加入25μg/m L的酪蛋白納米復合物100μL，然后對藥物進行二倍稀釋，即第1孔中加入藥液后用移液槍充分吹打（至少3次以上）使藥物與肉湯充分混勻，然后吸取100μL加入第2孔，再充分吹打使之與肉湯充分混勻，同樣吸取100μL加人第3孔中.照此重復直至最后一孔，吸取100μL棄去;此時每孔藥物濃度從上到下依次為25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.390μg/ml，并在第二列與第三列設置平行實驗。③在每一孔中加入稀釋好的大腸桿菌懸液100μL，這樣就形成測定一個藥物最小抑菌濃度值的3次重復。此時每孔藥物濃度即最終藥物濃度，從上到下依次為25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.390μg/ml。④繼續在每一孔中加入刃天青染液，區分抑菌效果。⑤重復上述步驟，再制作一個金黃色葡萄球菌的96孔培養板。⑥將2個96孔培養板放入37℃恒溫培養箱培養16～20h后，觀察結果。

3.結果與討論

3.1酪蛋白酸鈉的標準曲線

在色譜條件為：流動相為乙腈：0.5 %乙酸水 （44：56）;檢測波長為428 nm;流速為1 mL / min;柱溫為35 ℃;進樣體積為20 μL時，酪蛋白酸鈉的標準曲線如下圖所示：

3.2計算丹參酮-酪蛋白酸鈉膠束的包藏率

由3次實驗得到其吸光度值為：0.632，0.526，0.526。算出其吸光度平均值為0.561，帶入上述標準曲線：

y（吸光度）=0.0084x（濃度）-0.032

得酪蛋白濃度為70.6微克每毫升，再乘以酪蛋白溶液用量120mL，得酪蛋白質量為8.47mg，最后除以丹參酮質量10mg，計算得其包封率為84.7%。

3.3酪蛋白納米復合物的表征

下圖三條曲線分別是0.05g/L的丹參酮溶液，1g/L的酪蛋白酸鈉溶液和丹參酮-酪蛋白復合物溶液的紫外可見吸收光譜圖。

由光譜圖可知丹參酮在450mm處有一較大吸收峰，而包封后形成的丹參酮-NaC復合物在450mm處的吸收峰消失;因為游離的酪蛋白在275mm處存在吸收峰，故丹參酮-NaC復合物在此處存在一吸收峰。

所以上述內容表明實現了NaC對丹參酮的完全包封。

3.4用96孔板法測最小抑菌濃度

（1）下圖為大腸桿菌96孔培養板培養結果：

由圖可知：酪蛋白納米復合物對大腸桿菌的最小抑菌濃度是：12.5μg/ml。

（2）下圖為金黃色葡萄球菌96孔培養板培養結果：

由圖可知：酪蛋白納米復合物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度是：6.25μg/ml。

4.結語

冠心病是一種終身性疾病，血管中的斑塊一旦形成，很難徹底的消除，只能夠通過長期用藥穩定病情。然而，持續服用目前治療冠心病的藥物會對肝、腎等器官產生明顯的危害。相比傳統的治療冠心病的藥物，越來越多的天然生物活性分子因其低毒性，被認為是作為治療冠心病的長期服用藥物，最有希望的候選者。例如：丹參酮是從中藥丹參中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，經臨床試用證明治療心絞痛效果顯著，副作用小，為一治療冠心病的新藥，其有抗菌、消炎、活血化瘀、促進傷口愈合等多方面作用，長期服用未見有明顯副作用。但穩定性差，易受溫度、pH及溶劑影響，發生不同程度的解離，影響藥物效果。而找到有雙親性與自組裝功能的包藏物是解決這一問題的有效方法。酪蛋白是一種兩親性大分子共聚物，能夠發生自組裝成為一種優良的包埋材料，具有良好的穩定性并且能與小分子和離子相結合，能夠通過控制外部條件改變其結構和特性。其膠粒的兩親性和自組裝特性有助于提高其穩定性。本文選用酪蛋白與丹參酮形成丹參酮-酪蛋白酸鈉膠束復合物，并研究其性質與抑菌效果。

我們首先分別配置標準丹參酮、酪蛋白酸鈉和PBS緩沖溶液，繪制酪蛋白酸鈉的標準曲線。然后開始用酪蛋白包藏丹參酮并測其包封率，具體過程為：將容量瓶中的PBS溶液與酪蛋白酸鈉溶液，用量筒分別量取50ml至燒杯中，用移液槍移取5ml的丹參酮乙醇溶液于燒杯中充分攪拌，并通過吸光度與標準曲線計算得出其包封率為84.7%。接著，我們進行了復合物的溶解度、表征、抑菌實驗，具體步驟為：利用觀察法與紫外分光光度計法對比丹參酮包封前與包封后的溶解度差異。測量紫外可見吸收光譜檢測0.05g/L的丹參酮溶液，1g/L的酪蛋白酸鈉溶液，和原先已配置的丹參酮-酪蛋白酸鈉復合物溶液的光譜特性。并用用96孔板法并設置濃度梯度，測量最小抑菌濃度觀察結果。

最后從中得出的結論是：由3次實驗得到其吸光度，算出其吸光度平均值為0.561，帶入標準曲線公式，得酪蛋白濃度為70.6微克每毫升，再乘以酪蛋白溶液用量120mL，得酪蛋白質量為8.47mg，最后除以丹參酮質量10mg，計算得其包封率為84.7%。由光譜圖可知丹參酮在450mm處有一較大吸收峰，而包封后形成的丹參酮-NaC復合物在450mm處的吸收峰消失;因為游離的酪蛋白在275mm處存在吸收峰，故丹參酮-NaC復合物在此處存在一吸收峰。表明此實驗實現了NaC對丹參酮的完全包封。由96孔板法測最小抑菌濃度結果得知：酪蛋白納米復合物對大腸桿菌的最小抑菌濃度是：12.5μg/ml，酪蛋白納米復合物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度是：6.25μg/ml。

總之，針對像丹參酮一類的天然生物活性分子，使用酪蛋白納米膠束對其進行較好的包藏，并且可以明顯增加其穩定性。本文通過對：酪蛋白納米膠束的構建及其對藥物穩定性的影響的研究，不僅可以對冠心病的臨床治療上有所幫助，同時也可以為制藥工程提供新的思路。

參考文獻

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作者簡介：丁霽（2000-），女，北京人，本科在讀，組長，主要從事生物工程等研究。

陳沅芷（2000-），女，江西南康人，本科在讀，組員，主要從事生物工程等研究。

唐澤巖（2001-），男，河南鄭州人，本科在讀，組員，主要從事生物工程等研究。

王韜（2001-），男，山西太原人，本科在讀，組員，主要從事生物工程等研究。

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