賴氨酸特異性脫甲基酶2B與p21在卵巢癌組織中的表達及其臨床意義*

侯海瑞，楊慧蘭，蘇善恒，譚彩春，況 燕，易葉葉，黃俊寧，劉婷基

（廣西醫科大學第一附屬醫院婦產科，南寧 530021）

在全球范圍內，卵巢癌是女性第七大常見癌癥和第八大常見癌癥死亡原因，5年生存率低于45%[1]。因其缺乏特異性篩查手段，早期診斷困難，發現已是中、晚期，治療難度大，易復發的特點，嚴重影響著女性的生命健康。因此，探索卵巢癌的發生發展機制，尋找新的特異性靶點來提升卵巢癌早期診斷和改善預后，降低患者死亡率刻不容緩。

細胞增殖和死亡(凋亡)的失衡必然導致腫瘤的發生。p21是一種成熟的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，被發現在控制細胞周期進程中發揮重要作用[2]。一些證據發現腫瘤發生與p21 蛋白改變之間的聯系[3]。賴氨酸特異性脫甲基酶2B(lysine-specific demethylase 2B,KDM2B)，是通過影響組蛋白甲基化的狀態對其靶基因進行表觀遺傳調控，在多種腫瘤中起促癌作用。KDM2B 與p21 均在不同程度上對腫瘤的發生發展起作用。盡管p21已在卵巢癌中得到研究，但其作為預后指標的作用仍然存在著爭議[4-5]。然而，KDM2B與p21在卵巢癌中的關系尚不清楚。本研究旨在觀察KDM2B 和p21 在不同病理類型卵巢組織中的表達情況，分析兩者之間的相互關系及與卵巢癌臨床病理特征的相關關系，為探索卵巢癌的發生發展機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年4月至2020年4月在廣西醫科大學第一附屬醫院進行診治的112例卵巢疾病患者的卵巢組織標本，包括20例正常卵巢組織（來源于患子宮肌瘤、子宮腺肌病行全子宮雙附件切除術的患者），33例良性卵巢組織（14例黏液性囊腺瘤、19例漿液性囊腺瘤），53例上皮性卵巢癌組織（30例漿液性腺癌、23例黏液性腺癌），6例非上皮性卵巢組織（3例透明細胞癌、3例性索－間質瘤）。所有病例在取材前均未接受藥物、放化療等特殊治療，并經過組織病理學檢查明確診斷。本研究經過本院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒購自美國Axygen公司；逆轉錄試劑購自Takara公司；熒光染料SYBR Green 購自Throme公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；KDM2B 兔多克隆抗體（SAB 公司，批號：47690）；p21兔單克隆抗體（Abcam公司，批號Ab109520）；SP 試劑盒（博士德生物公司，批號：SV0002）和DAB 顯色試劑盒（博士德生物公司，批號：AR1022）。

1.3 免疫組化法檢測卵巢組織KDM2B和p21表達 實驗過程嚴格按照試劑使用說明書進行。其中KDM2B及p21抗體工作液分別為1∶50和1∶100，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。最終在顯微鏡下觀察結果。KDM2B陽性定位為細胞核和（或）胞質內出現棕黃色褐色顆粒，其他著色程度強度明顯高于背景非特異性染色即定義為陽性表達；p21 陽性定位為細胞核成強烈且廣泛的顆粒狀染色時認定p21染色陽性。在光學顯微鏡下，每張切片隨機取5個視野，每個視野根據染色強度計分和陽性細胞百分比。染色程度評定：不著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細胞百分比評定：＜2.5%為1分，2.5%～50%為2分，50%～70%為3分，＞75%為4分。最后將染色程度和陽性細胞百分比相乘作為最終判定結果：0分為陰性（－），1～4分為弱陽性（+），4～8分為中度陽性（++），8～12分為強陽性（+++）。其中+、++、+++均為陽性表達。

1.4 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測卵巢組織KDM2B 和p21 表達 取40 mg組織標本于液氮中研磨，根據RNA 提取試劑盒說明書提取組織中總RNA，用Nandrop2000檢測RNA濃度及純度后按照逆轉錄說明將RNA逆轉錄為cDNA，以β-actin為內參，在Applied Biosystems 7300 PCR 儀上進行檢測。引物序列如下：KDM2B 上游：5’-ACTGTGGTAGACCTGGTGGACTG-3’，下游：5’-AATGGCGTTCGTGGCTTCTGTC-3’；P21 上游：5’-GCCCGTGAGCGATGGAACTTC-3’，下游：5’-CCTGCCTCCTCCCAACTCATCC-3’；β-actin 上游：5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3’，下游：5’-GGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3’。PCR 反應體系20 μL：cDNA 模板2 μL，上、下游引物各1 μL、SYBR Green Master 10 μL、RNA-free H2O 6 μL。采用2-△△Ct法計算KDM2B、p21 基因相對表達量。實驗重復3次。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以百分率（%）表示，率的比較采用χ2檢驗，采用Spearman相關系數進行相關性分析；計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同卵巢組織中p21和KDM2B蛋白表達陽性率比較 卵巢癌組織中KDM2B蛋白陽性表達率高于正常卵巢組織、良性卵巢組織，p21蛋白陽性表達率低于正常卵巢組織、良性卵巢組織（均P＜0.05），見表1、圖1。

表1 不同卵巢組織中p21和KDM2B蛋白表達陽性率比較 n(%)

2.2 不同卵巢組織中p21 mRNA和KDM2B mRNA的表達情況 惡性卵巢組織p21 mRNA表達水平低于正常卵巢組織、良性卵巢組織；KDM2B mRNA表達水平高于正常卵巢組織和良性卵巢組織（均P＜0.05），見圖2。

2.3 p21和KDM2B蛋白表達與卵巢癌臨床病理特征的關系 p21在低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結轉移的卵巢癌組織中的表達陽性率低于中、高分化、FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移（P＜0.05），而KDM2B 蛋白表達情況相反（P＜0.05）；不同年齡段p21 和KDM2B 蛋白表達陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.4 卵巢癌中KDM2B與p21蛋白表達的相關性

在卵巢癌組織中KDM2B 與p21 蛋白表達呈負相關關系（r=－0.978，P=0.000）。

圖1 免疫組化檢測不同卵巢組織中p21和KDM2B的表達情況

圖2 qPCR檢測不同卵巢組織中p21和KDM2B mRNA的表達情況

表2 p21和KDM2B蛋白表達與卵巢癌臨床病理特征的關系 n(%)

3 討論

卵巢癌是世界上最致命的婦科惡性腫瘤[6]。其高死亡率的原因主要是卵巢癌在最初發現時已是晚期且有轉移和發展為化療耐藥性的特點[7]。盡管，外科手術和化療藥物有了很大的進步，但患者的死亡率仍得不到改善。

p21在正常細胞中作為細胞周期抑制因子和抗增殖效應因子發揮作用，在一些癌癥中發揮異常調控作用[2]。p21 可以通過參與多種信號途徑來影響癌癥的放療效果，其功能在癌癥中的復雜而重要的作用成為癌癥治療的靶標[8]。p21的下調或者失活，導致正常細胞周期調控失調，細胞增殖增加，并導致惡性腫瘤[9]。有研究表明在催乳素瘤中，降低p21能夠使腫瘤的增殖和遷移增加[10]；在食道癌中，p21作為細胞周期激酶抑制劑，通過p53 依賴性途徑來可以調節細胞周期進程[11]。但有證據表明，在其他腫瘤類型(如甲狀腺癌或子宮內膜癌)中，情況恰恰相反[12-13]。因此，p21 可以是一種致癌蛋白，也可以是一種抑癌蛋白，這取決于其在細胞質或細胞核中的定位[14-15]。本研究中，免疫組化的結果顯示，p21蛋白在惡性卵巢組織中的陽性表達率低于正常卵巢組織、良性卵巢組織（P＜0.05）；且p21 蛋白陽性表達率隨著腫瘤組織分級及FIGO分期的增加反而表達降低（P＜0.05），有淋巴結轉移的陽性表達較低（P＜0.05）。qPCR 結果表明，在mRNA 水平上，p21在惡性卵巢組織中的表達比在正常卵巢組織和良性卵巢組織中的表達的要低（P＜0.05）。這一結果提示p21可能在卵巢癌的發生發展中起著一定的作用。

表觀遺傳調控主要包括非編碼RNA的DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、核小體定位和轉錄后基因調控[16]。組蛋白甲基化是最常見的組蛋白修飾，在調節基因轉錄中具有高度動態性[17-18]。此外，組蛋白甲基化既可以激活基因表達，也可以抑制基因表達，這取決于組蛋白甲基化位點[19-20]。KDM2B是一種重要的組蛋白賴氨酸去甲基酶，又稱JHDM1B/FBXL10/ NDY1，是一種保守且廣泛表達的核蛋白。它靶向H3K36me2 和H3K4me3 去甲基化[21-22]。它參與細胞衰老、細胞分化和干細胞自我更新等細胞正常過程的許多方面[23]。據報道，KDM2B 在急性淋巴細胞白血病（ALL）、急性髓系白血病（AML）、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌和膀胱癌中表達顯著升高[24-28]，且與腫瘤分級呈正相關關系。而且，KDM2B在基底樣三陰性(ER-、PR-和Her2-)乳腺癌中高表達，并且是其一個不良預后因子[26]。KDM2B 在胃癌中也是高表達的，被作為預后較差的危險因素[29]。在本研究中，免疫組化結果顯示，在惡性卵巢組織中，KDM2B 的蛋白陽性表達率高于正常卵巢組織和良性卵巢組織(P＜0.05)；qPCR 的結果也表明，KDM2B 在惡性卵巢組織中的表達高于正常卵巢組織和良性卵巢組織(P＜0.05)，且隨著組織學分級和FIGO 分期的增加而升高(P＜0.05)，有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移(P＜0.05)。與Wang 等[30]在腦膠質細胞瘤中的研究結果相一致。本實驗結果表明，KDM2B 在卵巢癌的發生發展中起著一定的作用，然而KDM2B 在卵巢癌中的作用機制及發展預后仍需進一步研究。

P21 是一種周期蛋白依賴性激酶抑制劑，通常通過p53相關途徑誘導、調控細胞周期的進程，進而影響細胞增殖和凋亡，兩者失去平衡將導致腫瘤生成。KDM2B 是一種組蛋白去甲基化酶，有研究表明，抑制KDM2B 表達促進膠質瘤細胞系的細胞周期進程，導致G0/G1期細胞百分比上升，而S期細胞百分比下降。另外，沉默KDM2B 可以增強p21 蛋白的表達，降低cyclin D1的表達[30]。在多種癌細胞中，cyclin D1 是一種促癌基因蛋白，在細胞周期中調控g1-s 期的轉變[31]。這些結果表明，KDM2B 與p21可能通過調節細胞周期相關因子來影響細胞增殖和凋亡的平衡，進而導致腫瘤的生成。本研究結果表明，p21 在卵巢癌組織中低表達，KDM2B 在卵巢癌組織中高表達，p21和KDM2B分別參與卵巢癌的發生發展。本研究還發現，p21與KDM2B呈負相關關系（P＜0.05），因此推測KDM2B 與p21 互相作用共同參與卵巢癌的發生發展，兩者可能通過調節細胞周期相關因子進而使細胞增殖和凋亡失去平衡而導致腫瘤的生成，可能成為卵巢癌靶向治療及判斷預后的參考指標。

綜上所述，在卵巢癌組織中，KDM2B 與p21 呈負相關關系，KDM2B 在卵巢癌中高表達，p21 在卵巢癌中低表達，兩者可能以不同的方式共同參與卵巢癌的發生發展。這可能成為治療卵巢癌的新方向，擴寬了卵巢癌治療的新思路。KDM2B和p21在卵巢癌中的發展機制有待進一步研究。