青蒿琥酯對伴牙周病I型糖尿病大鼠腦組織病變及TNF-ɑ、Caspase-3表達的影響*

馬楚彬，農曉琳，陳 怡，梁 晨

（廣西醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，南寧 530021）

糖尿病(DM)是一種代謝紊亂疾病，它通過一定的機制直接或間接影響大腦和行為反應。許多證據表明，DM 患者面臨嚴重的腦并發癥[1]。近年來，牙周炎與DM的關系也受到極大關注。在臨床實踐中，DM 患者的血糖控制不良會使患牙周炎的可能性增加，已有牙周炎的甚至能加快其進展速度[2-3]。DM 患者常同時存在較嚴重的牙周病，它會引起慢性炎癥反應，可能對血糖控制產生不良影響[4]。長期慢性高血糖改變了血腦屏障的功能和結構，使血管通透性增加，神經毒性基質進入大腦，影響神經功能。有研究發現，神經元細胞變性、凋亡導致的神經元數目減少是造成認知功能障礙的病理基礎[5]。細胞凋亡不僅影響正常發育中的神經系統，在各種急慢性神經退行性疾病的病程進展中也起重要作用。而在牙周病人牙齦組織破壞的炎癥進程中，凋亡相關因子的表達量有所增加[6-7]。因此，如何有效控制DM和牙周炎的進程，進而控制血糖，預防腦并發癥的發生或改善其病理進展是尚待解決的重要難題。

青蒿琥酯（artesunate，ART）為青蒿素的衍生物，有抑制炎癥因子形成的功效[8]。此外，ART還有抗腫瘤的作用，并且由于其良好的耐受性，ART 常用于與其他藥物進行的混合配置[9-10]。作為治療腦型瘧疾最有效的藥物，近期的研究發現，ART 在治療腦型瘧疾的過程中還能緩解腦的炎癥狀態[11-12]。ART 能夠透過血腦屏障到達腦內并且維持較高的濃度，這個特性使它能夠成為一種治療中樞神經系統疾病及神經功能紊亂的備選藥物[13]。有研究團隊對外傷性腦損傷進行研究時發現ART 具有抗凋亡作用，從而證實ART具有一定的保護神經細胞的作用[14]。同時ART 對1 型DM 還具有一定的預防作用[15]。因此，本實驗構建了1型DM和牙周病大鼠模型，并以不同濃度的ART進行藥物干預。處死大鼠取材后通過蘇木精－伊紅（HE）染色來觀察腦組織病理改變，使用免疫組化染色分析腦組織相應部位腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白的表達情況，探究ART不同的干預濃度對腦組織病變的影響，為臨床中口腔－全身疾病的預防及治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥物 選擇SPF級SD大鼠，雄性，6 周齡，約200 g，購于廣西醫科大學實驗動物中心。大鼠在SPF 級實驗室中使用亞籠飼養，在20～25 ℃的環境溫度下自由進食和飲水。鏈脲佐菌素（STZ）與戊巴比妥鈉購于美國sigma 公司，ART 購買于桂林南藥股份有限公司（國藥準字H10930195）。

1.2 實驗分組 試驗性喂養1周后，將48只大鼠隨機分為6組，即對照組、1 型DM組（DM）、伴牙周病1 型DM組（DM&PD）、ART低劑量干預組（DM&PD ART 10 mg/kg）、ART中劑量干預組（DM&PD ART 30 mg/kg）、ART高劑量干預組（DM&PD ART 60 mg/kg），每組8只。確認成模后，各干預組每日分別予ART 10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg灌胃治療，持續4周。

1.3 構建模型 大鼠腹腔注射1%STZ(60 mg/kg)構建1 型DM 模型。注射后第3、第7、第14 天尾尖采血測空腹血糖值，若均高于16.7 mmol/L，則確認建模成功。使用正畸結扎絲結扎上頜磨牙頸部，同時在齦溝內涂布牙齦卟啉單胞菌菌液來構建牙周病模型。之后觀察牙周情況，若出現牙齦出血紅腫、牙槽骨吸收、附著喪失等相關牙周病病征即可確認牙周病造模成功。

1.4 終末血糖測定 用藥4周后，尾尖針刺后用羅氏試紙采血，使用快速血糖儀（羅氏活力型，德國）測大鼠空腹血糖值。之后使用過量戊巴比妥鈉溶液麻醉處死大鼠。

1.5 制作石蠟切片組織固定液（4%多聚甲醛）固定大鼠腦組織，24 h 后，沿矢狀面切成厚度約2 mm的薄片，采用二甲苯以及75%、85%、95%、無水酒精進行梯度脫水，浸蠟后在包埋機上進行包埋。包埋好的蠟塊-20 ℃冷凍2 h 后在切片機上進行連續切片。恒溫箱中60 ℃烤片4 h后裝盒備用。

1.6 HE染色觀察腦組織病理學改變（1）脫蠟、復水：將切片放入二甲苯、二甲苯、二甲苯、無水乙醇、95%酒精、85%酒精、75%酒精各5 min，蒸餾水洗3 次。（2）蘇木精染細胞核：將切片放入新配的蘇木精染液中1 min，掛缸30 s，蒸餾水洗3次，1%鹽酸酒精分化10 s，蒸餾水洗3次，返藍10 min，顯微鏡下觀察細胞核均藍染著色后，行下一步。（3）伊紅染細胞質：將切片置入伊紅染液中5 s，后蒸餾水洗3 次。（4）脫水封片：將染好后的切片置烤片機上充分烤干，中性樹膠封片。（5）顯微鏡觀察，采集圖像并分析。

1.7 免疫組化染色觀察TNF-ɑ、Caspase-3表達情況 取切片按上述脫蠟復水步驟操作后，用枸櫞酸溶液（pH=6.0）浸沒，置于高壓鍋內高壓修復5 min，取出后自然冷卻至室溫，去離子水洗3次。后用3%過氧化氫溶液浸泡10 min，阻斷內源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗3 次。后將切片在山羊血清中封閉10 min，甩去血清后加一抗TNF-α、Caspase-3（稀釋倍數1∶250）置于4 ℃冰箱過夜。第二天取出切片回復至室溫，PBS 洗3 次后滴加二抗并37 ℃孵育10 min。PBS 洗3 次后滴加辣根素（SAB）置于37 ℃孵育10 min。PBS 洗3 次后滴加DAB 顯色液，約3 min 流水輕柔沖洗，蘇木精復染，顯微鏡下觀察到細胞核著色后用1%鹽酸酒精分化10 s，染色即完成。按上述步驟干燥并封片。之后使用Nikon正置熒光顯微鏡拍攝腦組織切片相應陽性表達區域。400 倍率觀察并采集圖像。采用Image pro plus6.0軟件分析計算圖像中相應部位TNFɑ、Caspase-3 蛋白陽性表達的平均光密度值(mean optical density,MOD)。

1.8 統計學方法 采用SPSS 20.0 軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的終末血糖值比較 與對照組比較，DM組與DM&PD組大鼠的終末血糖值顯著較高，且DM&PD組升高更明顯（P＜0.01）。各干預組血糖值有不同程度的下降（P＜0.01），其中DM&PD ART 60 mg/kg組下降較為明顯，DM&PD ART 10 mg/kg組、DM&PD ART 30 mg/kg組較為接近，見圖1。

2.2 腦組織HE染色結果 在對照組大鼠腦組織皮層運動區中，神經元結構較完整，細胞膜、細胞質、細胞核結構清晰，層次清楚。DM組大鼠皮層出現核固縮和核深染的神經元數量明顯增加，DM&PD組更明顯。3個不同ART濃度的治療組神經元細胞結構和形態均有不同程度的改善，神經元核固縮和核深染的數量明顯降低（圖2a）。不同組別核固縮和核深染的神經元的占比（異常神經元細胞數量/視野下的總細胞數量）結果（圖2b）。DM組與DM&PD組異常神經元占比明顯高于對照組（P＜0.01），DM組比DM&PD組低（P＜0.05）。各ART干預組異常神經元占比明顯低于DM&PD組（P＜0.01），ART 30 mg/kg組和ART 60 mg/kg組低于ART 10 mg/kg組（P＜0.01），說明ART 干預可能減輕神經元退行性變，且與濃度有關。

2.3 腦組織TNF-α，Caspase-3免疫組化染色結果

各組大鼠腦組織皮層運動區神經細胞細胞質和胞膜中均見有TNF-α、Caspase-3的棕黃色顆粒表達（圖2a）。各組間相互比較可發現（圖2c,2d），DM組及DM&PD組TNF-α、Caspase-3 的表達明顯要高于對照組，且DM&PD組TNF-α、Caspase-3 的表達高于DM組（均P＜0.01）。不同ART 劑量的干預組TNF-α、Caspase-3 的表達明顯低于DM&PD組。TNF-α 的表達量 在DM&PD ART 10 mg/kg組 與DM&PD ART 30 mg/kg組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）,而DM&PD ART 60 mg/kg組的表達量明顯低于DM&PD ART 10 mg/kg組與DM&PD ART 30 mg/kg組（P＜0.01）。Caspase-3的表達量在DM&PD ART 10 mg/kg組與DM&PD ART 30 mg/kg組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而DM&PD ART 60 mg/kg組的表達量明顯低于DM&PD ART 10 mg/kg組與DM&PD ART 30 mg/kg組（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠終末血糖值比較

3 討論

在牙周病的影響下，DM 引起的腦組織病變會朝更嚴重的方向發展，這是一個多因素互相影響的過程，最終常常導致患者認知功能弱化，嚴重的甚至生活難以自理。因此，對于伴牙周病的DM 腦組織病變相關機制的研究有重要的意義。本研究通過注射STZ 并對大鼠磨牙區進行結扎涂菌來構建伴牙周病I型DM模型，參考了國內外學者的常用方法[16-17]。成模效果良好，模型組的大鼠可見明顯的DM及牙周炎癥表現，可見其多飲多食多尿，體重反而下降，伴有牙齦出血、牙周附著喪失、牙周溢膿、牙槽骨有一定程度的吸收。課題組前期實驗已嘗試使用50 mg/kg ART 和100 mg/kg ART 灌胃干預，發現100 mg/kg ART干預降糖效果較好，但與50mg/kg ART相比并無太大差別。同時還發現，過高濃度的ART干預對大鼠的肝腎代謝有一定毒副作用，故嘗試本實驗中所采用的3種ART干預濃度來探究較為合理的劑量。

通過HE 染色的結果可以發現，對照組大鼠大腦皮層中的神經元結構完整，排列緊密，層次清楚。DM組大鼠皮層出現核固縮和核深染的神經元數量明顯增加，且細胞間隙增大，數量減少，體積縮小。這在DM&PD組更為明顯。而在3個不同ART濃度的治療組中可觀察到神經元細胞結構和形態有不同程度的改善。為了進一步研究，筆者對大鼠大腦皮層中的TNF-ɑ、Caspase-3 表達量進行了分析。

在牙周病及DM 進展的過程中，TNF-ɑ 是一個重要的起促炎作用的因子。TNF-α是一種從具有免疫活性的細胞釋放的具有促炎作用的可溶性遞質。它能促進前列腺素合成，促進腫瘤生長，激活破骨細胞功能，促進骨吸收。TNF-α 的各項作用表明它在介導由感染或其他損害導致的免疫炎癥反應的過程中扮演重要的角色[18]。在牙周病患者中能檢測到高濃度的TNF-α，說明其對牙周病程的進展有重要作用。同時，又有研究報道，DM患者增長的TNF-α激活了各種應激酶，使胰島素底物受體（IRS-1）磷酸化，進而擾亂胰島素信號傳導[19-21]。胰島素信號通路對于神經細胞行使正常的功能有重要的作用，因而炎癥介導的信號通路的改變會導致神經細胞功能的缺陷[22-24]。

研究證實，DM患者若伴有牙周病，他們的血糖會更難控制[25-27]。在本實驗中，從腦組織皮層中測得的TNF-ɑ 表達量可以發現，DM&PD組明顯高于DM組（P＜0.01），可見牙周病確實在一定程度上加大了DM引起的腦組織炎癥的嚴重程度。3個治療組ART的濃度逐漸提高，TNF-ɑ的表達量逐漸降低（P＜0.01），說明ART 可能緩解了腦組織的炎癥狀態，且濃度越高效果越好。

近年來，關于DM 引起的腦并發癥的研究較熱門，許多學者將DM與阿爾茨海默病（AD）聯系在一起，將其列為AD的獨立危險因素。最近對AD病程的研究發現，在細胞凋亡過程中，Caspase-3 裂解了細胞中的早老素（與早期發病的家族性AD 有關）。基于此，一種假說認為Caspase-3介導的相關蛋白的裂解可能促進神經退行性疾病的發生并最終導致神經元非正常的凋亡[28]。有實驗提出，這一行為可能促進Aβ蛋白的病理性增長，誘發細胞凋亡，使神經元發生退行性變化，最終導致認知障礙的發生[29-31]，但具體機制仍待探究。本實驗通過免疫組化確實能觀察到Caspase-3 在DM&PD組的表達量明顯高于DM組（P＜0.01），當ART干預的濃度較高時，Caspase-3 的表達量更低（P＜0.01）。說明ART也許通過控制Caspase-3 的表達來緩解腦組織神經細胞的凋亡進程，從而起到保護神經細胞的作用。

綜上所述，本研究通過構建1 型DM 和牙周病模型，探究了伴牙周病1 型DM 大鼠腦組織炎癥相關機制及神經細胞凋亡水平，并采用不同濃度的ATR 進行干預，發現其能有效降低腦組織炎癥反應，保護神經細胞，減少其凋亡。分析得出較高濃度的ART對伴牙周病1型DM引起的腦組織病變有一定的防治作用。本課題組近期研究發現，伴DM牙周炎大鼠腸道上皮有所損傷，通透性改變，會造成腸道菌群組成變化。相關研究發現，腦－腸－菌群間存在相互作用，腸道菌群改變會影響腦穩態，使得患者進食的回饋機制和抑制機制出現問題，可能進一步加重DM進展。之后的研究可朝此方向深度探究。同時，本研究對于炎癥和凋亡相關通路的探索比較局限，尚待進一步的深入探究。