破骨細胞敲除PDK1基因對PMMA顆粒誘導的小鼠顱骨骨溶解抑制作用的實驗研究*

張保德，宗少暉

（廣西醫科大學第一附屬醫院脊柱骨病外科，南寧 530021）

全球每年有數百萬例患者接受關節置換術，且呈逐年遞增趨勢。人工關節置換術是治療各種終末期骨性關節病最普遍、有效的方法，但隨著假體植入時間的延長，假體發生磨損，導致不同程度的磨損微粒產生，是局部骨溶解、炎性假瘤及假體無菌性松動（aseptic loosening,AL）的主要原因[1-3]。研究發現，破骨細胞性骨質溶解和骨吸收繼發于巨噬細胞吞噬/胞飲磨損顆粒后所引發的機體免疫反應[4-6]。據報道，磨損微粒通過刺激巨噬細胞等炎性細胞釋放大量化學介質，促進破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化，抑制破骨細胞凋亡，增強骨吸收破骨細胞活性，使假體周圍發生骨溶解[2,6-10]。本實驗旨在通過建立聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）顆粒骨吸收動物模型來研究敲除破骨細胞3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1）基因對PMMA 顆粒誘導顱骨骨溶解、破骨細胞形成及骨吸收活性的影響，為臨床治療和預防人工假體周圍骨溶解導致的無菌性松動提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6雄性8周齡野生型小鼠12 只，由廣西醫科大學實驗動物中心提供（動物生產許可證號：SYXK 桂2020-0004）。破骨細胞敲除PDK1 基因C57BL/6 雄性小鼠6 只，本課題組自行繁育所得，稱重并標記。溫度（23±2）℃，相對濕度（50±10）%。

1.2 PMMA 顆粒的制備 PMMA 顆粒購自美國Polysciences 公司，形態規則、微球形，直徑1～10 μm，經掃描電鏡（HITACHI Regulus 8100）檢測證實顆粒平均直徑6.0 μm，95%顆粒直徑＜10 μm。將顆粒溶于75%乙醇，室溫下振蕩清洗4 次，每次1 h，100%乙醇浸泡滅菌，12 h 后用PBS 清洗4 次，每次1 h，將處理后的PMMA 顆粒重懸于無血清α-MEM培養基中，配成濃度為30 g/L的溶液，于4 ℃冰箱中保存備用[11]。

1.3 實驗分組及骨吸收模型建立 將12只C57BL/6野生型小鼠隨機分為假手術（Sham）組和PMMA+C57BL/6組，每組6 只。6 只破骨細胞敲除PDK1 基因C57BL/6 小鼠為PDK1 基因敲除（PMMA+KO）組，其中PMMA+C57BL/6組和PMMA+KO組術中均添加PMMA顆粒。

顱骨骨吸收模型的建立：1%戊巴比妥鈉20 mg/kg劑量腹腔注射，待麻醉后用繃帶將四肢及頭部固定于自制小動物手術臺上，俯臥位，用無菌眼科剪剔除小鼠頭頂部毛，碘伏棉球消毒頭部皮膚，75%酒精脫碘，無菌條件下在小鼠顱骨正中矢狀縫位置縱向切開頭皮，大小約0.5 cm×0.5 cm，暴露外骨膜，用骨膜剝離器剝離外骨膜，顯現顱骨，PMMA+C57BL/6組和PMMA+KO組注入30 g/L PMMA 顆粒懸液100 μL，Sham組注射不含PMMA 顆粒的α-MEM培養液100 μL，4-0 線間斷縫合，建立骨吸收動物模型。每只小鼠術后均給予肌肉注射注射用青霉素鉀3 萬單位，防止術后感染。所有小鼠飼養在SPF級屏障環境，自由活動，飲水進食。

1.4 顱骨Micro-CT分析骨吸收溶解變化情況 10 d后，Sham組、PMMA+C57BL/6組、PMMA+KO組各取3只小鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下取小鼠頭骨，剔除外層皮膚和肌肉，立即用4%中性多聚甲醛固定液固定，48 h 后取出用無菌PBS 浸泡清洗3 次，每次5 min。然后利用Micro-CT 機掃描顱骨，觀察各組小鼠顱骨骨吸收溶解變化情況。

1.5 組織切片的制備 參考Warashina 等[12]動物樣本取材制備方法，處死小鼠后取頭頂骨，4%中性多聚甲醛固定48 h，常規組織脫鈣、脫水、石蠟包埋，連續切片（厚5 μm），分別行蘇木精—伊紅（HE）染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。

1.6 骨組織計量學分析組織切片行常規HE 染色，光學顯微鏡下觀察顱骨各類骨相關細胞分布和骨表面溶解侵蝕情況，每組選3個樣本進行分析，采用Image-Pro Plus 6.0（IPP）圖像分析軟件測量顱骨正中矢狀縫區域骨吸收溶解面積，并計算骨溶解面積百分比。TRAP 染色是破骨細胞的特異性染色。臨近骨組織的區域胞漿染色呈鮮紅色陽性，胞核≥3個為破骨細胞。Olympus 電子顯微鏡下，每個樣本采集5 個不同的視野，通過形態學計算正中矢狀縫區域的破骨細胞數量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠顱骨Micro-CT掃描結果 術后10 d，PMMA+C57BL/6組較Sham組顱骨骨破壞溶解面積顯著增加，PMMA+KO組較PMMA+C57BL/6組顱骨骨溶解面積明顯減少，見圖1。

2.2 顱骨骨組織切片HE染色結果 PMMA+C57BL/6組顱骨骨吸收明顯增加，顱骨表面可見大量炎性肉芽組織侵襲及瘢痕組織生成，同時可見大量炎性細胞（如巨噬細胞、多核巨細胞、成纖維細胞等）和破骨細胞。與Sham組相比，PMMA+C57BL/6組顱骨骨破壞溶解面積明顯增加（P＜0.01）；而PMMA+KO組較Sham組相比溶解面積不明顯（P＞0.05），較PMMA+C57BL/6組顱骨骨溶解面積顯著減少（P＜0.01），見圖2。

2.3 顱骨骨組織切片TRAP 染色結果 在置入PMMA 顆粒后，破骨細胞數目顯著增加，光鏡下可見許多骨吸收陷窩和臨近骨組織區域呈鮮紅色胞漿陽性的破骨細胞（黑色箭頭所示）。與Sham組相比，PMMA+C57BL/6組破骨細胞數目明顯增多（P＜0.01）；而PMMA+KO組較PMMA+C57BL/6組破骨細胞數目顯著減少（P＜0.01），PMMA+KO組與Sham組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖1 骨溶解術后10 d Micro-CT 掃描觀察骨溶解三維重建情況

圖2 PMMA顆粒骨溶解誘導模型（HE染色，×4）及各組骨溶解面積百分比

圖3 PMMA顆粒骨溶解誘導模型（TRAP 染色×20）及各組破骨細胞數目

3 討論

人工關節置換術是目前骨科的主要進展性手術之一，在臨床上廣泛用于解除老年骨性關節炎、創傷性關節炎、類風濕性關節炎、老年股骨頸骨折等疾病所引起的疼痛和功能障礙并恢復關節功能，讓患者提高生活質量恢復基本日常生活活動。但是，相當多的患者在關節置換后經歷了無菌性松動（aseptic loosening，AL）。AL 的唯一有效糾正方法是手術翻修。一種較新的策略涉及開發新的藥理學方法以改善AL相關的骨溶解。目前認為磨損顆粒被巨噬細胞被吞噬/胞飲后通過各種機制，如細胞因子和趨化因子的釋放、巨噬細胞集落刺激因子的增加、級別配體表達的增加和蛋白酶的誘導等激活破骨細胞并導致破骨細胞前體細胞增殖分化為破骨細胞，最終導致骨溶解吸收[2,5,13-14]。

PDK1 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可調控細胞生長、代謝、增殖、分化及凋亡等，其作為主激酶負責許多其他AGC激酶的磷酸化和激活，且僅在磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯或磷脂酰肌醇3,4-二磷酸酯的脂質囊泡存在時才能激活蛋白激酶B（Akt）蘇氨酸殘基Thr308位點及其下游靶蛋白等，并使其磷酸化或抑制[15-17]。目前涉及細胞核因子-κB受體激活配體（receptor or activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）與其膜受體細胞核因子-κB受體活化因子（receptor or activator of nuclear factor-κB,RANK）結合的信號通路是破骨細胞分化、存活和骨吸收能力的關鍵[18]，除NF-κB 外，RANKL 還參與PI3K/Akt和MEK/ERK等信號途徑以促進破骨細胞活化。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PDK1 是多種細胞信號通路中的關鍵節點[19-20]，有實驗發現，PDK1 在破骨細胞活化及自噬誘導中具有強大的中心調控作用，抑制PDK1 可促進破骨細胞凋亡[21-22]。而敲除破骨細胞內該基因能否抑制AL 相關骨溶解的發展？基于此，本實驗構建了破骨細胞敲除PDK1基因小鼠，結果顯示，與Sham組相比，敲除破骨細胞PDK1 基因后能顯著抑制由PMMA顆粒誘導的骨溶解。

綜上所述，通過敲除小鼠體內破骨細胞PDK1基因可抑制破骨細胞的生成，進一步抑制PMMA顆粒誘導的骨質溶解和吸收，證實PDK1 在破骨細胞活化中起重要作用。