環狀RNA hsa_circ_0006689在系統性紅斑狼瘡中的分子機制的初步研究*

韋 悅，李文宇，范潤哥，侯 偉，溫斯健△，林有坤△

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科，南寧 530021；2.中國醫學科學院地中海貧血防治研究重點實驗室，南寧 530021；3.廣西地中海貧血防治重點實驗室，南寧 530021）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種以自身抗體產生及多器官受累為主要特點的自身免疫性疾病[1]，其發病機制尚未完全明確，既往研究認為其與遺傳、免疫、環境、激素水平等有關，而近來，表觀遺傳學在SLE 發病中的作用越來越受到重視[2-4]。功能性的非編碼RNA 對基因的調控作為表觀遺傳學中的重要機制之一，在SLE的發生發展中發揮著重要作用[5-6]。環狀RNA 是一類環狀非編碼RNA 分子，可通過“miRNA 海綿”等機制調節基因表達[6]。本課題組前期通過高通量測序技術檢測了SLE 患者及健康志愿者外周血單個核細胞（PBMC）中環狀RNA的表達，通過進一步驗證篩選出了hsa_circ_0006689。本研究以該前期工作為基礎，擴大樣本進一步探究hsa_circ_0006689在SLE中的表達并驗證其生物學特性，并初步探討其在SLE中可能的作用機制，為尋找新的SLE生物標記物提供科學依據，為SLE的發病機制研究提供新的視角及思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取廣西醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科2019年3月至2020年9月收治的30例SLE患者（觀察組）和34例健康志愿者（對照組）作為研究對象。觀察組中女27例，男3例，年齡12～59 歲，平 均（31.8±13.6）歲，均符合美國風濕病協會（ACR）1997年制定的SLE診斷標準，且已排除嚴重感染、妊娠、惡性腫瘤、糖尿病及其他自身免疫性疾病[7]。對照組均為女性，年齡18～26歲，平均（22.76±2.28）歲，滿足以下幾個條件：（1）非SLE患者，且無其他自身免疫疾病；（2）無重大疾病；（3）近3 個月來無使用激素、免疫抑制劑等藥物。依據系統性紅斑狼瘡疾病活動性指數（systemic lupus erythematosus activity index，SLEDAI）[8]對觀察組進行評分并分組，將觀察組中處于活動期的24例患者（SLEDAI 評分≥5）設為活動組，6例穩定期患者（SLEDAI 評分＜5）設為非活動組。本研究經廣西醫科大學倫理委員會批準（NO.倫審[2017-KY-國基-081]），受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

磷酸鹽緩沖液（PBS）、人外周血單個核細胞分離液（北京索萊寶公司）；Trizol RNA分離試劑、lipofectamine TM2000（美國invitrogen 公司）；逆轉錄試劑盒（日本TAKARA 公司）；2×Universal SYBR Green Fast qPCR mix（武漢愛博泰克公司）；hsa_circ_0006689、ACTB 引物（上海生工生物工程公司）；RNase R（美國epicentre 公司），胎牛血清、DMEM、Opti-MEM（美國GIBCO公司），Dual-Luciferase Reporter Assay System（美國Promega 公司）。Lightcycle 96 熒光定量PCR 儀（美國Roche 公司），熒光顯微鏡（德國LEICA 公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備公司），酶標儀（TECAN公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 PBMC提取 根據人全血單個核細胞分離液的操作說明，分離收集3 mL新鮮全血中的PBMC用于后續RNA提取。

1.3.2 RNA 提取與逆轉錄 使用Trizol 試劑提取PBMC 中的總RNA，用分光光度計測量RNA 的濃度及純度，隨后根據逆轉錄試劑操作說明在T100 Thermal cycler PCR儀上合成cDNA。

1.3.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測 通過circ-Base 網站（http://www.circbase.org/）獲取hsa_circ_0006689 的序列，將序列頭尾相接，使用NCBI 網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）設計引物，擴增產物須包含環化位點，以ACTB為內參，引物序列見表1，qPCR 反應體系，見表2。反應條件：95 ℃，3 min 預變性；95 ℃10 s，60 ℃60 s，共循環40 次；每間隔1 ℃收集1次熒光信號，根據溶解曲線分析擴增產物的特異性；每個樣本進行3 次技術重復，取3 次CT值平均值，采用2-ΔΔCT法，以ACTB 為內參，計算hsa_circ_0006689的相對表達量。

表1 基因引物序列

表2 qPCR反應體系

1.4 hsa_circ_0006689的耐酶消化特性

取一份上述RNA 平均分為2 份，分別加入RNsae R和等體積無酶水，反應體系見表3，混勻后置于普通PCR儀中孵育，37 ℃，20 min，隨后將消化后的產物進行常規逆轉錄，進行qPCR檢測，具體步驟同前。以RNase R(-)組的CT 值為參照，計算RNase R(+)組circRNA及mRNA的相對表達量。

表3 RNsae R反應體系

1.5 雙熒光素酶報告基因實驗

使用circBank（http://www.circbank.cn/）網站預測hsa_circ_0006689 可能結合的miRNA，篩選出可能結合的miRNA。將circ-0006689及其突變序列克隆至報告基因luciferase 下游構建表達載體；培養293T 細胞，當細胞生長至70%時，使用lipofectamine TM2000 將circ_0006689-Wt/Mut 與miRNA mimics 或陰性對照（NC）共轉染至293T 細胞，培養48h后使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.6 hsa_circ_0006689的調控網絡分析

分別使用TargetScan（http://www.targetscan.org/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）網站來預測上述所得miRNA 可能靶向的mRNA，取能被兩個網站共同預測到的mRNA 進行下一步分析。將交集所得的靶基因利用David v6.8（https://david.ncifcrf.gov/）進 行GO（gene ontology）和KEGG pathway分析。

1.7 統計學方法

采用SPSS 23.0、GraphPad Prism 8.0.2、Rstudio軟件進行數據分析及繪圖。首先將數據進行正態性檢驗，若數據符合正態分布則以均數±標準差（）表示，兩樣本比較采用t檢驗；若不符合正態分布則采用中位數（四分位數間距）[M（P25～P75）]表示，兩樣本比較采用非參數檢驗中的Mann-Whitney檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組hsa_circ_0006689相對表達量比較

觀察組PBMC 中hsa_circ_0006689 的相對表達量明顯低于對照組（P＜0.01），見圖1。進一步對觀察組中活動組與非活動組的hsa_circ_0006689 表達水平進行比較，差異無統計學意義（P=0.3），見圖2。

圖1 兩組hsa_circ_0006689相對表達量比較

圖2 觀察組中活動組和非活動組hsa_circ_0006689相對表達量比較

2.2 hsa_circ_0006689可耐RNase R消化

經RNase R消化處理后，hsa_circ_0006689的相對表達量有輕度升高，而作為mRNA的ACTB的相對表達量出現顯著降低，見圖3。表明hsa_circ_0006689具有較強的耐受RNase R酶消化的能力。

2.3 雙熒光素酶報告基因實驗

通過circBank（http://www.circbank.cn/）網站發現hsa_circ_0006689 可能靶向65個miRNA，見圖4。其中hsa-mir-1255a 堿基序列的種子區與hsa_circ_0006689存在2處結合位點，見圖5。雙熒光素酶報告基因實驗結果證實mir-1255a mimics可以顯著抑制circ_0006689-Wt 質粒的熒光強度（P＜0.05），而circ_0006689-Mut組質粒的熒光強度比較，差異無統計學意義（P＞0.05)，表明hsa_circ_0006689 可以靶向結合hsa-mir-1255a，見圖6。

圖3 RNase R 處理后hsa_circ_0006689 與ACTB 相對表達量比較

圖4 hsa_circ_0006689-miRNA網絡圖

圖5 hsa_circ_0006689、hsa-mir-1255a、circ_0006689-Mut 三者堿基結合位點

圖6 hsa_circ_0006689靶向結合hsa-mir-1255a

2.4 hsa-mir-1255a調控網絡分析

將hsa-miR-1255a 輸入TargetScan、miRWalk 網站來預測可能的靶基因，選擇能被兩個網站共同預測到的靶基因，共獲得1 050 個靶基[9]；RNA-seq 中下調的基因共8 196個差異基因，將預測的1 050個靶基因與RNA-seq中的差異基因取交集得到525個基因，見圖7，將上述525 個基因輸入，將交集所得525 個靶基因利用David v6.8（https://david.ncifcrf.gov/）進行GO和KEGG pathway分析。

圖7 hsa-mir-1255a靶基因與RNA-seq的交集

2.5 差異靶基因的GO分析

將上述525個靶基因進行GO分析，分別從分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）3個方面分析這些基因功能的富集情況，探究hsa_circ_0006689 在SLE 中潛在的作用機制。MF的結果顯示，靶基因主要富集在metal ion binding、receptor activity、transcription factor activity、sequence-specific DNA binding、GTP binding retinoic acid receptor binding、transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity、SMAD binding GTPase activity、transcription factor binding 等分子功能中富集。CC 結果提示，靶基因主要分布在cytoplasmic vesicle、intracellular、endoplasmic reticulum lumen、cytoplasm、cell junction、plasma membrane、endoplasmic reticulum membrane、neuromuscular junction、cytosol 等細胞組分，主要富集在胞質中。BP 結果提示主要在transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway、positive regulation of transcription,DNA-templated、signal transduction by protein phosphorylation、post-embryonic development、negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter、regulation of small GTPase mediated signal transduction、transcription,DNA-templated、positive regulation of mesenchymal cell proliferation、positive regulation of osteoblast different、activation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process等生物學過程，這些生物過程主要與轉錄調控和蛋白質磷酸化有關，見圖8。

2.6 靶基因的KEGG pathway分析

通過KEGG pathway 分析發現，靶基因富集在Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells、TGF-beta signaling pathway、Hippo signaling pathway、ErbB signaling pathway、Cell adhesion molecules（CAMs）、Amphetamine addiction、Chronic myeloid leukemia 等信號通路中。主要與信號轉導相關，其中TGF-beta signaling pathway 為免疫相關通路，見圖9。

圖8 靶基因的GO富集結果

圖9 靶基因KEGG pathway富集結果

3 討論

環狀RNA是一種由反向剪接、共價連接而形成的閉環非編碼RNA，它缺少常規mRNA 的5’帽子結構及3’poly A尾[10]，這個特點使得環狀RNA可以對耐受RNase R 的消化，其在組織中表達穩定的特性，使其具有潛力成為SLE的生物標記物。已經有學者報道，SLE 合并腎損害患者外周血中has_circ_0082688、has_circ_0008675 水平升高，可作為診斷和治療的潛在生物標志物[11]。Guo 等[12]研究發現hsa_circ_0000479 有可能成為診斷SLE 的一種新的生物標志物。本研究中，筆者所選擇的hsa_circ_0006689 經RNase R 消化處理后，線性結構的ACTB mRNA 相對表達量出現顯著降低，而環狀RNAhsa_circ_0006689 的相對表達量則出現輕度升高，這種升高考慮為線性RNA被消化后、環狀RNA相對富集所致，該結果一方面說明了hsa_circ_0006689 具有耐受RNase R 酶消化的特性，另一方面也從側面印證了hsa_circ_0006689 的環狀結構。此外，筆者也擴大樣本進一步驗證了hsa_circ_0006689 在SLE 患者中的表達較正常人下降（P＜0.05），結合本課題組前期已經發現hsa_circ_0006689 的表達與SLE 的活動度具有相關性，表明hsa_circ_0006689 生物學性質穩定，具有成為SLE生物標志物的巨大潛力。

目前已報道的環狀RNA 功能主要有：（1）作為miRNA的“海綿”；（2）充當蛋白質的“海綿”，增強蛋白質的功能；（3）充當支架來介導酶—底物復合物的形成并將蛋白質募集到特定的位置；（4）不依賴帽的翻譯功能；（5）與線性剪接發生競爭，影響其宿主基因的表達[6]。在腫瘤、心血管疾病、糖尿病、類風濕性關節炎等疾病中，環狀RNA被發現可以通過上述功能對這些疾病的發生發展起到調節作用。已有研究表明，環狀RNA 可以影響SLE 的發生發展，其中環狀RNA 作為“miRNA 海綿”作用的研究較多。研究發現，CircIBTK 在SLE 中表達下調，可能通過與miR-29b 結合來調節SLE 中DNA 去甲基化和AKT信號通路從而影響SLE的發生發展，并且可作為SLE 的生物標志物和治療靶點[13]。Zhang等[14]發現，hsa_circ_0123190 可能通過海綿吸附hasmiR-483-3p 在狼瘡性腎炎中充當ceRNA 來調節APLNR 的表達。Zhang 等[15]發現hsa_circ_0012919在SLE CD4+T 細胞下調，并且可以靶向結合miR-125a-3p 從而促進CD4+T 細胞中CD11a 和CD70 的DNA甲基化。

為進一步探討hsa_circ_0006689 作用的分子機制，本研究通過生物信息學分析發現，hsa_circ_0006689序列中存在兩個hsa-mir-1255a種子區的合位點，通過雙熒光素酶報告基因實驗證實了hsa_circ_0006689可以靶向結合hsa-miR-1255a。這一結果說明hsa_circ_0006689 可能通過與靶基因競爭性結合hsa-mir-1255a 從而調節靶基因的表達。使用TargetScan、miRWalk 網站預測hsa-mir-1255a的靶基因，構建hsa_circ_0006689-hsa-miR-1255amRNA 互作網絡，分析hsa_circ_0006689 可能的作用機制；通過預測共獲得525 個可能與hsa-miR-1255a 靶向結合的mRNA。對以上525 個靶基因進行GO、KEGG pathway分析后發現部分靶基因富集在跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號轉導途徑上，且與TGF-β 信號通路高度相關。目前多個研究表明TGF-β 信號通路、酪氨酸激酶信號轉導途徑與SLE的發生發展密切相關，可能通過影響免疫細胞的增殖、分化和激活而影響SLE 的發生發展[16]。研究報道，脾酪氨酸激酶（Sky）在SLE患者的T細胞中過表達，在免疫細胞中參與膜介導的信號轉導。抑制Sky表達可以改善（NZB x NZW）狼瘡易感小鼠T細胞的功能，減緩皮膚及腎臟病變的發展[17]。酪氨酸激酶2的基因多態性與SLE相關[18]。

綜 上，hsa_circ_0006689 在SLE 患 者PBMC 中明顯下調，且生物學性質穩定，可以耐受RNase R酶的消化；生物信息學分析發現hsa_circ_0006689 通過競爭性結合hsa-mir-1255a 從而調控靶基因的表達，這些靶基因與跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號轉導途徑及TGF-β 信號通路等免疫相關通路有關。我們有理由推測，hsa_circ_0006689 可能通過靶向結合hsa-mir-1255a 來調節跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號轉導途徑及TGF-β 信號通路，從而影響了SLE 的發生發展，并且有潛力成為幫助SLE 診斷和評估病情的生物標志物。