基于網絡藥理學和分子對接探討六味地黃丸治療糖尿病的作用機制*

黃紅麗，王慧豐，胡艷玲

（廣西醫科大學生命科學研究院，南寧 530021）

糖尿病（diabetes mellitus）是一種由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，發病原因主要有機體胰島素分泌受損或胰島素作用受損[1]。此病會引起如神經病變、腎病、視網膜病變、心血管疾病等多種并發癥[2]，嚴重威脅人類的健康。研究顯示，2019年全球約有4.63 億人患糖尿病，到2045年將會增長到6.29～7億人[3-4]，形勢非常嚴峻。對于這些人群而言，生活方式和工作方式的改變比較困難，故藥物成為治療糖尿病最好的選擇[5]。

中醫藥是利用辯證和整體的思維模式、方法來治療疾病[6]，體現整體性和多靶點相互作用。六味地黃凡最早記載于宋代錢乙《小兒藥證直訣·卷下諸方》中，由熟地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉和牡丹皮六味中藥經過加工制成，平補肝腎脾三陰，而以填補腎精為主，對多種疾病均有不同程度的效果[7-8]。六味地黃丸治療糖尿病相關的疾病已有研究，但疾病的病因和發病機制極為復雜，至今尚未闡明，不利于六味地黃丸這一名藥的開發和利用。網絡藥理學圍繞系統生物學、生物網絡構建和分析、連接性、冗余性和多效性等，將藥物作用網絡與生物作用網絡進行藥物機制、有效性、毒性、代謝特性的揭示[9]。分子對接技術運用生物信息和計算機等手段，通過模擬化合物小分子和疾病靶點之間相互作用情況，篩選結合效能較好的藥物和靶點，為新藥的開發和疾病的治療提供理論基礎。因此，本研究旨在通過網絡藥理學和分子對接技術著重闡明六味中藥通過多靶點、多通路治療糖尿病的作用機制，為疾病的研究和用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 疾病靶點相關基因查詢 以“diabetes mellitus”作為關鍵詞，利用在線數據庫DisGenet v6[10]（https://www.disgenet.org/）、T-HOD[11]（http://bws.iis.sinica.edu.tw/THOD/）和TTD[12]（http://db.idrblab.net/ttd/）檢索獲得糖尿病相關基因。

1.2 中藥成分及靶點蛋白篩選 分別以中藥名“熟地黃（Rehmanniae Radix Praeparata）”，“山茱萸（Cornus Officinalis Sieb.Et Zucc.）”，“茯苓[Poria Cocos（Schw.）Wolf.]”，“牡丹皮（Cortex Moutan）”，“山藥（Rhizoma Dioscoreae）”，“澤 瀉[Alisma Orientale（Sam.）Juz.]”作為關鍵詞，輸入TCMSP[13]（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索六味中藥的有效成分。根據ADME 算法，篩選有效成分的口服利用度（OB）≥30%，分子相似性（DL）≥0.18 的化合物并下載SMILE結構和2D結構。利用在線網站SwissTargetPrediction[14]（http://www.swisstargetprediction.ch/）上傳化合物的SMILE結構進行靶點預測，篩選可能性大于0 的靶點。沒有預測到靶點的化合物通過SEA[15]（http://sea.bkslab.org/）進行補充分析，篩選FIT值大于6的靶點。對于沒有SMILE結構的化合物通過PharmMapper[16]（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）上傳2D 結構預測靶點，篩選得分大于6的靶點。

1.3 藥物成分靶點網絡拓撲分析及關鍵靶標篩選

將藥物成分靶點導入Cytoscape3.2.1 進行藥物成分靶點網絡拓撲分析，構建成分靶點網絡。通過Venny2.1.0[17]（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲得疾病和成分的靶點的交集，導入Metascape[18]（https://metascape.org/）數據庫進行蛋白互作網絡的構建，并且利用Cytoscape3.2.1進行網絡可視化分析，構建六味中藥對治療糖尿病直接或間接靶點的生物學網絡。運用CytoHubba及MCODE插件篩選治療疾病的關鍵基因。使用CytoHubba插件的核心算法計算出基因的核心度，選取MCC 值前十的基因作為核心基因。再運用MCODE 插件，將K-Core值設置為2，其他參數默認，聚類得到7個核心模塊，取MCC值前十的基因和MCODE插件聚類得到的基因交集作為關鍵基因[19]。

1.4 GO功能富集分析以及KEGG通路分析 將交集基因輸入Metascape進行基因通路和生物過程富集分析。Metascape 富集資源來自KEGG Pathway、GO Biological Processes、Reactome Gene Sets、Canonical Pathways、CORUM,TRRUST、DisGeNET 和PaGenBase。將P＜0.01，得分大于3，富集系數大于1.5的基因納入富集群。選取富集的前20個結果進行條形圖可視化。運用DAVID[20]（https://david.ncifcrf.gov/）數據庫對交集基因進行KEGG 通路分析，利用在線繪圖工具Omicshare（https://www.omicshare.com）對基因數大于18 的通路進行可視化分析。

1.5 六味地黃丸主要活性成分與糖尿病關鍵靶點分子對接 通過pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索獲得六味地黃凡主要活性成分的2D結構，從Protein Data Bank（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中檢索獲取關鍵靶點的受體蛋白，將活性成分的2D結構和關鍵靶點的受體蛋白結構上傳至在線分析平臺DockThor[21]（https://dockthor.lncc.br/v2/）。定義活性位點，選擇算法精確度，開始分子對接。

2 結果

2.1 六味中藥和疾病靶點的預測 通過OB 和DL條件篩選獲得熟地黃化學成分2 種，山茱萸化學成分15種，茯苓化學成分15種，澤瀉化學成分9種，山藥化學成分14 種，牡丹皮化學成分9 種。刪除7 個重復的化學成分，共得到57個化合物有良好的口服利用度，經過靶點預測得到663 個化合物相關的靶點。其中，靶點數等于100 的化合物有16 個，靶點數大于100 的化合物有1 個，OB 值最大的為山蒟醇，64.01%；DL 值最大的為澤瀉醇C 醋酸酯，0.83，見表1。谷甾醇是熟地黃、山茱萸、澤瀉、牡丹皮4種中藥共有的，豆甾醇是熟地黃、山茱萸、山藥3 種中藥共有的。表1中僅列出了靶點大于等于100的化合物以及在多味藥中均含有的19個化合物。663個藥物靶點與1 331個糖尿病相關基因取交集共獲得交集基因204個。

2.2 化合物－靶點網絡構建及關鍵基因篩選結果

通過Cytoscape 3.2.1構建了化合物成分靶點網絡，見圖1，中間方塊為化合物（紅），從里圈到外圈依次為熟地黃（橙）、澤瀉（黃）、山茱萸（綠）、山藥（青）、牡丹皮（藍）和茯苓（紫）。在線平臺Metascape得到交集基因的7個聚類模塊：MCODE1、MCODE2、MCODE3、MCODE4、MCODE5、MCODE6、MCODE7，各模塊通路的描述見表2。Cytoscape 3.2.1插件CytoHubba及MCODE篩選得到10個治療疾病的關鍵基因：CNR1、ADORA1、HRH3、APP、NPY2R、DRD2、DRD4、MCHR1、NPY1R、OPRM1。

2.3 生物過程及通路富集結果 對204 個中藥－疾病交集基因進行Metascape 分析，見圖2a。結果顯示，六味地黃凡主要參與血液循環、細胞對氮化合物反應、胰島素抵抗、對脂多糖反應、信號介導白介素、鈣離子穩態等過程。進一步KEGG分析結果顯示，六味地黃丸治療糖尿病涉及的信號通路主要包括胰島素抵抗、胰島素信號通路、刺激神經組織的中的交互、TNF 信號通路、前列腺癌、HIF-1 信號通路、在癌癥蛋白聚糖、癌癥通路、T 細胞受體信號通路，主要涉及胰島素調節、代謝調節、抗腫瘤等途徑，見圖2b。胰島素抵抗是肥胖相關組織暴露于飲食中的營養物質增加的結果，導致有毒代謝副產品的累積[4]，Metascape 分析和KEGG 分析均富集到了胰島素抵抗相關的通路。

表1 六味中藥的19個主要有效成分

表2 7個聚類模塊對應的通路描述

圖1 藥物成分-靶點網絡圖

2.4 中藥主要活性成分與關鍵靶點分子對接結果 選取六味地黃丸的兩種最主要化學成分谷甾醇和豆甾醇與10 個關鍵靶點進行分子對接。研究表明，配體與受體相結合時，所需結合能越低，結合就越穩定，效果越好[22]。結果顯示兩種化合物與靶點MCHR1 總結合能最小，分別為-342.519 和-294.783 kcal/mol。與谷甾醇結合密切關系（Affinity）＜-7 kcal/mol 的蛋白結構有CNR1、HRH3、MCHR1和OPRM1，與豆甾醇結合密切關系（Affinity）＜-7 kcal/mol 的蛋白結構有CNR1、MCHR1 和OPRM1。見表3和圖3。

圖2 生物功能及KEGG通路富集結果

表3 六味地黃丸部分主要成分與關鍵靶點分子對接結合能 （kcal/mol）

圖3 主要化合物與關鍵靶點結合活性較好的分子對接結果圖

3 討論

本研究以六味地黃丸為主要藥物，研究其治療糖尿病的作用機制。運用網絡藥理方法分析六味中藥（山茱萸、熟地黃、牡丹皮、山藥、澤瀉、茯苓）的有效成分，構建六味地黃丸活性成分－靶點網絡，分析六味中藥中活性成分與靶點之間的相互關系。其中，澤瀉醇C 醋酸酯、谷甾醇、豆甾醇、山蒟醇、槲皮素和山奈酚[8]等是六味地黃丸的主要活性成分。澤瀉，是一味歷史悠久的常用中藥，具有降低血脂，降低血清膽固醇及抗動脈粥樣硬化的功效，澤瀉醇C 醋酸酯是澤瀉的一個三萜類活性成分。谷甾醇是熟地黃、山茱萸、澤瀉、牡丹皮4 種中藥的活性成分，具有降低血清膽固醇的作用，用于預防型高脂血癥和動脈粥樣硬化，豆甾醇是熟地黃、山茱萸、山藥的活性成分，具有抗腫瘤、降低血液膽固醇、抗骨關節炎、抗氧化、降血糖和甲狀腺等多種藥理作用[23-24]。血小板的過度活化與凝血、動脈粥樣硬化、炎癥和過敏等生理疾病相關，而研究發現山蒟醇提取物具有顯著的抗血小板活性的功效[25]。此外，有研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血糖等方面的作用，山奈酚具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等生物活性[8,26-27]，其他成分并未發現與糖尿病或降血糖直接相關。本研究發現六味地黃丸治療糖尿病的關鍵靶點CNR1、ADORA1、HRH3、APP、NPY2R、DRD2、DRD4、MCHR1、NPY1R、OPRM1，均與胰島素抵抗、PID IL2 通路、白細胞介素介導的信號通路有關。除了HRH3暫時沒有文獻報道與糖尿病的關系之外，其他基因均有明確的報道對糖尿病的分子調控作用。研究表明，多巴胺D2 受體基因（DRD2）/含錨蛋白重復和激酶域1TaqIA 基因（ANKK1 TaqIA）多態性會影響個體對高脂肪或高糖的食物的偏好，從而對健康產生影響[28]。實驗顯示高脂飲食會導致cannabinoid receptor gene（CNR1）表達增加，敲除CNR1 可以改善胰島素抵抗、內質網應激和脂質積累，因此治療性抑制CNR1可以緩解糖尿病性心臟病的進展[29]。Yip 等[30]發現adenosine A1 receptor（Adora1）表達的缺失可能導致胰高血糖素的分泌不受限制，導致Ⅰ型糖尿病的進展和臨床表現。提示六味地黃丸可能通過多種成分作用于糖尿病的多個靶點。

為了說明篩選出的主要靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究進行了Metascape 生物過程和信號通路分析以及KEGG 通路富集分析。分析得出六味地黃丸主要通過調節血液循環、參與細胞對含N 化合物的反應、參與脂多糖反應、參與細胞外刺激反應、鈣離子穩態等生物學過程治療糖尿病。大多數基因可富集到胰島素抵抗、胰島素信號通路、神經活性配體受體的相互作用、TNF 信號通路、前列腺癌、HIF-1 信號通路、癌癥蛋白聚糖等信號通路，可見，糖尿病的發生發展與多種疾病相關。研究顯示，糖尿病與腫瘤兩者之間存在獨立相關性。近年來研究發現，糖尿病可顯著升高胰腺癌、肝癌、結腸癌、乳腺癌和前列腺癌的患病風險[31]。研究表明肥胖患者[體重指數（Ibm）＞25 kg/m2]前列腺癌的惡性程度高于非肥胖患者，相比于正常血糖患者，高血糖患者更易導致高級別的前列腺癌，同時對前列腺癌細胞體外培養發現，高血糖誘導前列腺癌細胞中的miR-301a 表達，下調p21 和Smad4 的蛋白水平，導致細胞體內G1/S 周期轉變，從而促進前列腺腫瘤細胞增殖，但也有爭議提出，糖尿病患者前列腺癌的發病風險降低了14.0%[31-34]。從分子對接的結果可知，谷甾醇和豆甾醇與關鍵靶點CNR1、MCHR1 和OPRM1 結合的密切關系均小于-7 kcal/mol，說明這些關鍵靶點通過與主要化合物密切結合從而對糖尿病患者起作用。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學和分子對接技術初步探討了六味地黃丸多成分、多靶點、多通路的復雜機制過程。結果表明，六味地黃丸的多個成分均對糖尿病有直接作用，可能通過調節血液循環、參與脂多糖反應、胰島素抵抗的過程和通路對糖尿病起作用。同時，糖尿病和癌癥的關系表明六味地黃丸可能通過預防癌癥降低糖尿病的發病。分子對接顯示，谷甾醇和豆甾醇與CNR1、MCHR1和OPRM1等關鍵靶點有較好的結合活性。但六味中藥成分復雜，本研究僅從微觀角度證實其參與血液循環、抗腫瘤等機制，后續研究可在此基礎上加以實驗和臨床驗證，使其更有可信性和臨床意義。