香蜂草苷對脂多糖聯合D-氨基半乳糖誘導C57BL/6J小鼠急性肝損傷的保護作用及機制研究*

龐麗君 ，馮鐘文，陳思韻，黃瑀莘，龍 妍，黃權芳，林 興，韋錦斌△

（1.廣西醫科大學，南寧 530021；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023）

急性肝損傷在臨床上十分常見，可誘發急性肝損傷的危險因素有多種，如病毒、疾病及用藥不當等[1-2]，具有預后不良及高死亡率等特性，嚴重危害人類生命健康。因此，迫切需要開發急性肝損傷的特效藥。脂多糖（LPS）聯合D-氨基半乳糖（D-Gal）腹腔注射是一種常用于研究藥物治療急性肝損傷潛在機制的經典研究模型。LPS 具有很強的毒性，可以激活免疫系統并最終導致敗血癥經常引起多器官衰竭，特別是肝損傷。此外，D-Gal作為LPS的增敏劑，可通過抑制多種RNA 的合成，增強肝臟內LPS的肝毒性[3]。

香蜂草苷是一種黃酮類化合物，具有較強的抗炎和抗氧化的作用[4]。本課題組前期研究發現，香蜂草苷對四氯化碳（CCl4）所致的急性肝損傷具有良好的保護作用[5]。然而，目前關于香蜂草苷對LPS和D-Gal 引起的急性肝損傷的影響尚無相關報道。因此，本實驗通過LPS/D-Gal誘導小鼠急性肝損傷，研究香蜂草苷對小鼠急性肝損傷的保護作用及其作用機制，為急性肝損傷和其他急性炎癥性疾病的治療提供新的靶標和潛在的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠90只，體重（20±2）g，購于湖南天勤生物技術有限公司（動物使用許可證號：SYXK 湘2014-0011），控制溫度（25±2）℃，相對濕度60%～70%，光照強度300 Lx，每日光照時間12 h。本研究中涉及小鼠的所有實驗均符合廣西醫科大學動物倫理委員會批準。

1.2 試劑與主要儀器 香蜂草苷，純度≥98%，批號：P13S9L70276，購于上海源葉生物科技有限公司；聯苯雙酯滴丸，批號：170610，購于北京協和藥廠；LPS（批號：813Q038，Solarbio）；D-Gal（批號：KT052019，BOMEI）；NF-κB p65、IKKα/β和p-IKKα/β 兔源單克隆抗體（美國CST 公司）；白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物研究所）；組織裂解液（碧云天生物技術有限公司）。7100型全自動血生化分析儀（日本Hitachi公司）；Nanodrop3000微量核酸蛋白分析儀（美國Thermo Fisher 公司）；CKX-41 倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Western blotting 電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Red公司）；Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統（美國LICOR公司）。

1.3 動物分組及造模 將90 只C57BL/6 小鼠隨機分為6組（n=15）：正常對照組、香蜂草苷對照組（0.8 mg/kg 香蜂草苷）、模型組、陽性對照組（175 mg/kg聯苯雙酯）及香蜂草苷低、高劑量組（0.4 mg/kg、0.8 mg/kg 香蜂草苷）。正常對照組和模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，其余各組灌胃給予相應藥物，共14 d。預處理結束時，除正常對照組和香蜂草苷對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射D-Gal（800 mg/kg）和LPS（50 μg/kg）建立急性肝損傷模型[6]；4 h后，根據實驗要求進行進一步的操作。

1.4 樣本采集和處理 各組小鼠腹腔注射對應藥物4 h 后，用乙醚麻醉并采用摘眼球取血法取新鮮血液于1.5 mL 離心管中，隨后頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出小鼠肝臟，血液靜置30 min 后離心20 min。采用4 ℃生理鹽水清洗肝臟表面后，用濾紙吸干表面液體并將其切成若干塊，分裝置于-80 ℃冰箱冷藏保存。

1.5 病理組織學檢查[7]用4%多聚甲醛固定肝組織，石蠟包埋，切片，厚度為5 μm，行蘇木精－伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察肝臟病理改變。

1.6 生化指標測定 采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）活性。

1.7 血清炎癥因子水平測定 采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定L-1β、IL-6 和TNF-α 含量。酶標儀檢測450 nm 波長處各孔光密度（OD）值，并根據說明書計算小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.8 氧化應激指標檢測 稱取適量小鼠肝臟，按重量∶體積=1∶9的比例加入相應體積的生理鹽水，在冰浴條件下對其進行勻漿，隨后組織勻漿于4 ℃下離心10 min，保留上清液。用BCA試劑盒對各組樣本的蛋白濃度進行定量，嚴格按照試劑盒說明書檢測小鼠肝臟SOD活性和MDA含量。

1.9 Western blotting 法檢測肝組 織p-IKKα/β、IKKα/β 及NF-κBp65 蛋白表達 取適量肝臟組織，剪碎，放入玻璃勻漿器中，加入RIPA緩沖溶劑，在冰上研磨。靜置10 min 后，4 ℃下離心20 min，取上清。BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。7.5%～12.5%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，采用濕轉法將分離的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，1 h后將PVDF膜取出，用TBST溶液搖床洗滌3次，10 min/次；封閉15 min，TBST 洗滌3 次，10 min/次；將PVDF 膜與相應的一抗（均為1∶1 000）置于4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗滌3次，10 min/次；熒光二抗（1∶10 000）于室溫條件（25 ℃）下避光搖床孵育1 h，TBST 洗滌3 次，10 min/次。Odyssey 雙色紅外成像系統進行掃膜，Image J2軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.10 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠肝病理組織學變化的影響 HE 染色結果顯示，正常對照組小鼠肝組織結構清晰可見，肝小葉以及肝細胞完整；模型組小鼠肝組織出現明顯的病理改變，包括水腫或充血，肝細胞壞死，肝組織結構破壞，炎癥細胞浸潤，中央靜脈不規則擴張；與模型組相比，香蜂草苷低、高劑量組肝組織病理形態學改變較模型組均有明顯改善，且香蜂草苷高劑量組改善更明顯，見圖1。

圖1 HE染色觀察小鼠肝臟組織學變化（×400）

2.2 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響 與正常對照組相比，模型組血清AST和ALT 活性明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，香蜂草苷低、高劑量組血清ALT、AST活性均降低，且香蜂草苷高劑量組低于香蜂草苷低劑量組（P＜0.05），見表1。

2.3 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 與正常對照組比較，模型組血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；香蜂草苷低、高劑量組血清IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平均低于模型組，且香蜂草苷高劑量組TNF-α含量低于香蜂草苷低劑量組（P＜0.05），見表2。

表1 香蜂草苷預處理后小鼠血清ALT和AST活性變化 n=15，

表1 香蜂草苷預處理后小鼠血清ALT和AST活性變化 n=15，

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與香蜂草苷高劑量組比較，△P＜0.05。

表2 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平變化 n=15，

表2 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平變化 n=15，

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與香蜂草苷高劑量比較，△P＜0.05。

2.4 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠血清中SOD 活性和MDA 含量變化的影響 與正常對照組比較，模型組血清SOD 活性顯著降低，而MDA 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，香蜂草苷低、高劑量組血清MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，且香蜂草苷高劑量組改善更明顯（P＜0.05），見表3。

表3 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響 n=15，

表3 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響 n=15，

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與香蜂草苷高劑量組比較，△P＜0.05。

2.5 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠肝組織p-IKKα/β及NF-κB p65 蛋白表達的影響 與正常對照組比較，模型組NF-κB p65、p-IKKα/β蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）；經香蜂草苷預處理后，香蜂草苷低、高劑量組NF-κB p65、p-IKKα/β蛋白表達均顯著下調，且香蜂草苷高劑量組NF-κB p65蛋白表達量低于香蜂草苷低劑量組（P＜0.05），見圖2、表4。

圖2 香蜂草苷對小鼠肝臟中P-IKKα/β、IKKα/β及NF-κB蛋白表達的影響

表4 香蜂草苷對小鼠肝臟p-IKKα/β 及NF-κB p65 蛋白表達的影響 n=15，

表4 香蜂草苷對小鼠肝臟p-IKKα/β 及NF-κB p65 蛋白表達的影響 n=15，

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與香蜂草苷高劑量組比較，△P＜0.05。

3 討論

LPS 作為一種強大的炎癥因子，可激活免疫細胞，使其分泌促炎因子，導致炎癥性肝損傷[8-9]。此外，D-Gal是一種特異性的LPS致敏劑，導致三磷酸尿苷（UTP）大量耗損，同時抑制RNA 的合成[10-11]。正常情況下，AST 和ALT 主要存在于肝細胞中，當肝臟受到一些有害因素的刺激時，許多肝細胞被破壞后，繼而將AST 和ALT 釋放到血液中，導致血清中AST和ALT水平顯著升高[12]。因此，血清ALT和AST水平可作為肝細胞損傷的標志，用來評估肝損傷的嚴重程度。本研究發現，模型組ALT和AST活性顯著升高（P＜0.05），且HE 染色結果顯示肝組織出現嚴重的病理改變：肝組織結構被破壞，炎癥細胞浸潤，肝細胞壞死，提示急性肝損傷模型復制成功；與模型組比較，香蜂草苷低、高劑量組ALT 和AST 活性顯著降低，高劑量組效果最優（P＜0.05）；病理組織檢查結果顯示，經香蜂草苷預處理后，肝細胞結構損壞、充血、壞死等現象均得到明顯改善，且高劑量組的治療效果明顯優于低劑量組。以上結果提示香蜂草苷對LPS/D-Gal誘導的急性肝損傷有一定的保護作用，且高劑量香蜂草苷效果更好。

研究表明，急性肝損傷的發病機制復雜多變，但氧化應激始終扮演著十分重要的角色。在LPS/D-Gal 誘導的急性肝損傷中，機體氧化系統和抗氧化系統的失衡導致肝細胞氧化損傷[13]。SOD 作為一種抗氧化酶，促進氧化－抗氧化劑的平衡。SOD可催化超氧化物歧化產生過氧化氫，防止氧中毒。另一方面，MDA 在肝臟脂質過氧化起到十分重要的作用。這兩種物質在體內的異常變化可能會使氧化應激加劇，從而導致細胞受損甚至死亡[14]。本研究中，模型組小鼠SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）。而香蜂草苷預處理可提高SOD 的活性，同時降低MDA 含量（P＜0.05）。這些結果表明，香蜂草苷可增加肝細胞的抗氧化能力，減少氧化損傷，最終保護LPS/D-Gal誘導的肝損傷。

研究表明，炎癥反應是導致LPS/Gal 引起肝損傷的主要因素。而IL-1β、IL-6和TNF-α在與炎癥反應中扮演著重要的角色。決定了急性肝損傷的發生及病程的發展[15]。實驗結果表明，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平顯著升高（P＜0.05），經香蜂草苷預處理后，IL-1β、IL-6和TNF-α的異常升高現象得到明顯改善（P＜0.05），且高劑量組改善程度較低劑量組更優。以上結果提示香蜂草苷可能通過抑制小鼠肝臟炎癥反應，從而起到治療LPS/D-Gal所引起的急性肝損傷的作用。NF-κB是一種重要的核轉錄因子，活化后的NF-κB可促進多種炎癥介質的轉錄及分泌，繼而參與生理和病理過程的調節[16]。本研究表明，模型組NF-κB p65、p-IKKα/β 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），經香蜂草苷預處理后，NF-κB p65、p-IKKα/β表達水平明顯降低（P＜0.05），且香蜂草苷高劑量效果更優。提示香蜂草苷減輕炎癥因子的過度釋放，可能與抑制NF-κB信號通路有關。

綜上，香蜂草苷能減輕LPS/D-Gal 誘導的急性肝損傷，其機制可能與抑制炎癥反應、氧化應激以及NF-κB信號通路的激活有關，本研究為香蜂草苷作為一種治療急性肝損傷的新藥提供了實驗依據。