腦惡性腫瘤缺失基因1對子宮內膜癌的作用及其機制*

何 琳，楊志峰，袁 鴻，宋 冉，劉 丹

（河北省保定市第二醫院婦科，保定 071051）

子宮內膜癌（endometrial carcinoma）起源于高度再生的子宮腔，是繼乳腺癌和宮頸癌之后第3 大婦科惡性腫瘤[1]。被診斷為子宮內膜腫瘤轉移到淋巴結或遠處器官的患者通常治療選擇有限[2]。因此，為了開發新的治療方法，有必要更好地了解子宮內膜癌發生發展的潛在機制。腦惡性腫瘤缺失基因1（deleted in malignant brain tumors 1，DMBT1）是一種340 ku 的糖蛋白，位于染色體10q25.3-q26.1上，通常參與黏膜固有免疫[3]。已有研究表明，癌組織中DMBT1 的低表達與癌癥的發生、發展有關[4]。Galectin-3 是Galectin 家族一種29～35 ku 的蛋白質。galectin-3在子宮內膜癌患者血清中表達上調，且與癌癥進展相關。Galectin 3 可作為子宮內膜癌患者的獨立預后因素[5]。此前，已有研究表明，DMBT1 和galectin-3 間存在相互作用[6]。因此，本研究旨在探究DMBT1在子宮內膜癌組織中的表達及其對子宮內膜癌細胞的作用，進一步探究其作用是否與galectin-3相關，以期為探明子宮內膜癌的發病機制及開發新的子宮內膜癌治療策略提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要細胞及試劑

人子宮內膜上皮細胞EEC 和人子宮內膜癌細胞Ishikawa 購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMBT1 過表達載體、galectin-3 過表達載體及其空載體購自武漢金開瑞生物工程有限公司；Lipofectamine2000 購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix 購自美國APExBIO 蘇州宇恒生物科技有限公司；DMBT1 和galectin-3 抗體購自英國Abcam 公司；GAPDH 抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；超敏ECL化學發光試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel購自美國BD公司。

1.2 臨床資料

選取2017年4月至2018年9月于河北保定市第二醫院住院經手術切除的子宮內膜癌患者的癌組織31例作為子宮內膜癌組。患者年齡35～73歲，平均（53.58±11.63）歲。病例納入標準：經組織病理確診為子宮內膜癌；術前未接受放化療及激素治療；無其他腫瘤病史；無重要臟器嚴重功能障礙；無嚴重感染；無血液系統、免疫系統疾病。另外，選取同期于本院門診體檢，經宮腔鏡取組織活檢病理證實的正常子宮黏膜組織標本31例作為正常對照組，患者年齡32～77 歲，平均（56.06±13.15）歲。正常對照組所有患者均無其他疾病史、特殊治療史及腫瘤疾病史。子宮內膜癌組和正常對照組年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究獲得本院倫理委員會批準，所有患者知情并簽署知情同意書。

1.3 免疫組化（IHC）檢測DMBT1表達

子宮內膜癌組織及正常對照組織經福爾馬林固定50 min，梯度酒精脫水、二甲苯透明。常規石蠟包埋、切片。組織切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育4 min。10% BSA 封閉液37 ℃孵育40 min。滴加DMBT1 抗體稀釋液（1∶200），4 ℃冰箱孵育過夜。滴加二抗（1∶200），37 ℃溫箱內孵育40 min。PBS緩沖液洗滌切片。滴加DAB 顯色劑，室溫顯色10 min。自來水終止顯色。蘇木精染液復染，1%鹽酸酒精溶液分化3 s，藍化10 s。梯度酒精脫水、二甲苯透明。中性樹膠封片。通過IHC 評分對染色結果進行統計[7]，IHC評分為染色強度和染色面積得分之積，其中無著色、弱著色、中等著色和強著色分別記為0 分、1 分、2 分和3 分；染色面積＜1%、染色面積1%～10%、染色面積11%～50%、染色面積51%～80%和染色面積＞80%分別記為0分、1分、2分、3分和4分。

1.4 細胞培養

Ishikawa 細胞和EEC 細胞用含10%FBS 的DMEM 培養基，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每2 d 更換1 次新鮮培養基，待細胞密度達到80%～90%時，0.25%胰酶液消化細胞，按照1∶3 比例傳代培養。收集對數期生長的Ishikawa 和EEC 細胞，分別命名為Ishikawa組和EEC組，RT-PCR 和Western blot檢測細胞DMBT1 mRNA和蛋白表達。

1.5 細胞分組與轉染

接種對數期生長的Ishikawa 細胞于6 孔板中，每孔4×105個細胞。細胞繼續培養12 h 后，將細胞隨機分為空白對照組、陰性對照（NC）組、DMBT1組和DMBT1+galectin-3組，根據Lipofectamine2000說明書，NC組轉染空載體陰性對照NC，DMBT1組轉染DMBT1 過表達載體，DMBT1+galectin-3組進行DMBT1過表達載體和galectin-3過表達載體的共轉染，同時轉入Ishikawa 細胞。空白對照組不進行轉染操作，加入等量PBS。轉染結束后，細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養，48 h 后，進行后續實驗操作。

1.6 RT-PCR檢測DMBT1 mRNA表達

收集轉染后的Ishikawa細胞。取出凍存的子宮內膜癌組織及正常對照組織剪碎。Trizol法提取細胞和組織中的總RNA，隨后測定樣品的RNA濃度，并將其逆轉錄成cDNA，此為RT-PCR 實驗中的模板，DMBT1 上游引物：5’-CCCTGGACGATGTAGAGTGC-3’，DMBT1 下游引物：5’-GGAACGGGTGATGTTGAGAAA-3’；GAPDH 上游引物：5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，GAPDH 下游引物：5’-TCCTGGAGGGATGGTGATGGG-3’。按照2×SYBR Green qPCR Master Mix 說明書進檢測DMBT1 mRNA 表達。反應條件：95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40 個循環；擴增條件：95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算DMBT1 mRNA表達。

1.7 Western blotting檢測DMBT1和galectin-3蛋白表達

收集轉染后的Ishikawa細胞。取出凍存的子宮內膜癌組織及正常對照組織剪碎，細胞裂解液裂解細胞及組織，收集上清液，測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。取30 μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳操作。封閉液室溫封閉2 h，DMBT1抗體稀釋液（1∶1 000）、galectin-3 抗體稀釋液（1∶2 000）和GAPDH 抗體稀釋液（1∶5 000）4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。超敏ECL 發光液顯色，暗室曝光。

1.8 CCK-8檢測檢測細胞增殖能力

取Ishikawa細胞接種到96孔板中，每孔100 μL細胞懸液（5×103個細胞），37 ℃、5%CO2條件下繼續培養0 h、24 h、48 h 和72 h 后，向每孔內加入10 μL CCK-8 溶液，培養板于37 ℃培養箱內孵育4 h。用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度（OD）值。

1.9 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲

遷移：消化Ishikawa細胞，新鮮培養基終止消化后棄去，重新添加無血清培養基重懸細胞，調整細胞密度至5×105個/mL。取100 μL 細胞懸液加入Transwell 小室，下室則加入600 μL 含20% FBS 的DMEM培養基，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。取出Transwell小室，棄去孔內培養基，甲醛固定30 min，風干。0.1%結晶紫染色20 min，微鏡下觀察、記數。侵襲：Matrigel 按1∶8 比例稀釋后，包被Transwell小室底部膜上室面，37 ℃孵育至凝固。后續操作與遷移實驗步驟相同。

1.10 統計學方法

采用SPSS21.0 統計學軟件進行數據分析。計量數據采用均值±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗；以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜癌組與正常對照組組織中的DMBT1表達情況比較

子宮內膜癌組中DMBT1 mRNA表達較正常對照組明顯降低（P＜0.05），子宮內膜癌組中DMBT1 IHC 評分較正常對照組明顯降低（P＜0.05），見圖1。

2.2 Ishikawa組與EEC組中DMBT1表達的比較

Ishikawa組中DMBT1 mRNA 及其蛋白表達較EEC組明顯降低（P＜0.05），見圖2。

2.3 過表達DMBT1 對子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

空白對照組DMBT1的蛋白表達與NC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），DMBT1組DMBT1的蛋白表達較NC組明顯升高（P＜0.05）。空白對照組和NC組在24 h、48 h 和72 h 的OD 值比較，差異無統計學意義（P＞0.05），DMBT1組細胞在24 h、48 h 和72 h 的OD 值較NC組明顯降低（P＜0.05）。空白對照組和NC組細胞遷移數和侵襲數比較無明顯差異（P＞0.05），DMBT1組細胞遷移數和侵襲數較NC組明顯降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 過表達DMBT1對galectin-3表達的影響

空白對照組和NC組中galectin-3的蛋白表達比較無明顯差異（P＞0.05），而DMBT1組中galectin-3的蛋白表達較NC組明顯降低（P＜0.05），見圖4。

2.5 過表達galectin-3 逆轉DMBT1 對子宮內膜癌細胞增殖的影響

DMBT1組中DMBT1的蛋白表達較NC組明顯升高（P＜0.05），DMBT1組和DMBT1+galectin-3組中DMBT1 的蛋白表達比較無明顯差異（P＞0.05）；DMBT1組中galectin-3 的蛋白表達較NC組明顯降低（P＜0.05），DMBT1+galectin-3組細胞中galectin-3 的蛋白表達較DMBT1組明顯升高（P＜0.05）。DMBT1組細胞在24 h、48 h 和72 h 的OD 值較NC組明顯降低（P＜0.05）；DMBT1+galectin-3組細胞在48 h 和72 h 的OD 值較DMBT1組明顯升高（P＜0.05），24 h 的OD 值與DMBT1組比較無明顯差異（P＞0.05），見圖5

2.6 過表達galectin-3 逆轉DMBT1 對子宮內膜癌細胞遷移和侵襲的影響

DMBT1組細胞遷移數和侵襲數較NC組明顯降低（P＜0.05）；DMBT1+galectin-3組細胞遷移數和侵襲數較DMBT1組明顯升高（P＜0.05），見圖6。

圖1 子宮內膜癌組與正常對照組組織中DMBT1的表達

圖2 Ishikawa組與EEC組中DMBT1的表達情況

圖3 過表達DMBT1對子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 Western blot檢測過表達DMBT1對galectin-3蛋白表達的影響

圖5 過表達galectin-3逆轉DMBT1對子宮內膜癌細胞增殖的影響

圖6 Transwell實驗檢測過表達galectin-3逆轉DMBT1對子宮內膜癌細胞遷移和侵襲的影響

3 討論

子宮內膜癌是美國最常見的婦科惡性腫瘤，2018年新增病例約63 230例，死亡病例11 350例。子宮內膜癌病例約占女性所有癌癥病例的6%[8]。由于肥胖、高血壓、糖尿病和其他已知子宮內膜癌危險因素的增加，年輕患者子宮內膜癌的發病率可能會增加[9]。子宮內膜癌的標準治療方法對晚期或復發性子宮內膜癌患者作用不佳[10]。因此，需要尋求新的子宮內膜癌治療策略來改變子宮內膜癌疾病現狀。

DMBT1 是一種分泌性清除劑蛋白，具有黏膜固有免疫和上皮細胞分化和再生的功能，作為先天性免疫防御分子和感染抑制劑發揮重要作用[11]。Garay等[12]的研究表明，在對幽門螺桿菌感染的反應中，DMBT1可能介導了黏膜保護，降低了發生胃癌前病變的風險。目前的研究表明，DMBT1 在宮頸鱗癌組織中表達下調，DMBT1 的低表達與宮頸鱗癌的FIGO 分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移、腫瘤分化程度有關。體外實驗結果顯示，過表達DMBT1 可抑制宮頸鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡[13]。此外，DMBT1在膽管癌中的抗腫瘤作用也得到了證實[14]。本研究結果顯示，DMBT1在子宮內膜癌組織和細胞系中表達下調。體外實驗顯示，過表達DMBT1 可抑制子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲，提示DMBT1 在子宮內膜癌中可能發揮著抗腫瘤作用。

Galectin-3屬于β-半乳糖苷結合蛋白家族。Galectin-3作為一種胞漿蛋白，可以輕易地穿過細胞和質膜進入細胞核和線粒體，調節多種生物學過程[15]。大量研究表明，galectin-3 以不同的方式在腫瘤的進展中起著重要作用，如介導腫瘤的生長、血管生成、化療抵抗、免疫抑制、侵襲和轉移[16]。有研究者合成了對細胞外和細胞內galectin-3 具有很高靶向性的多價糖共聚物抑制劑，隨后將其處理不同腫瘤細胞，結果發現galectin-3抑制劑可抑制大腸癌細胞、乳腺癌細胞、黑色素瘤細胞和前列腺癌細胞的遷移和擴散[17]。抑制galectin-3 可增強卵巢癌細胞順鉑敏感性[18]。同樣的，galectin-3 也參與子宮內膜癌的進展。Galectin-3 在子宮內膜癌組織中的高表達分別與腫瘤深度、組織學分級和組織學類型顯著相關[19]。目前，已有研究表明，DMBT1 通過抑制galectin-3 表達發揮抗腫瘤作用[20]。本研究結果顯示，過表達DMBT1可抑制子宮內膜癌細胞中galectin-3 的表達，而過表達galectin-3 則會逆轉DMBT1對子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。該結果表明，DMBT1 可能通過抑制galectin-3 的表達，在子宮內膜癌中發揮抗腫瘤作用。

綜上所述，DMBT1 在子宮內膜癌組織和細胞系中表達下調，過表達DMBT1 通過抑制galectin-3的表達，從而抑制子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲。