木犀草素對糖尿病性白內(nèi)障大鼠的晶狀體保護作用及對MEK/ERK信號通路的影響研究*

燕潔靜，喬 瑛，王芬芬

（1.西安市第一醫(yī)院眼科，西安 710002；2.西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安 710077）

糖尿病性白內(nèi)障是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制尚不明確，國內(nèi)外研究也尚未發(fā)現(xiàn)安全有效的用于治療糖尿病性白內(nèi)障的藥物，目前臨床中主要采用手術治療等方式治療[1]。由于手術治療存在復發(fā)率高、術后不良反應多等缺點，所以，對于糖尿病性白內(nèi)障的治療藥物開發(fā)任務仍十分艱巨。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MEK/ERK 通路與糖尿病性白內(nèi)障等糖尿病并發(fā)癥密切相關[2-3]。木犀草素是從多種植物中提取得到的黃酮類天然化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[4]，近年來被證實其對糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性白內(nèi)障等多種疾病均具有顯著作用[5-6]。本文通過研究木犀草素對糖尿病性白內(nèi)障大鼠的晶狀體保護作用及對MEK/ERK 通路的調(diào)節(jié)作用，旨在為木犀草素的藥理作用研究及糖尿病性白內(nèi)障藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

木犀草素(北京索萊寶科技有限公司，貨號SL8300，純度≥98%)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司，貨號S0130，純度≥98.5%)；MEK、ERK兔單克隆抗體(賽默飛世爾科技有限公司，貨號13-3500、13-6200)；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IGg、Beyozol(總RNA 抽提試劑)、BeyoRT?II cDNA第一鏈合成試劑盒(RNase H-)、實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒(碧云天生物科技有限公司，貨號P0018、A0208、R0011、D7168、D7268)；蘇木精－伊紅（HE）染色試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司，AR1180-100)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR引物設計及合成由賽默飛世爾科技公司完成；WELLReader 全自動酶標儀(德國R-BIOPHARM)；KMC MICROTOME 手動輪轉(zhuǎn)切片機(美國KOSTER)；Omega Fluor 凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像儀(美國Aplegen)；BX63 自動熒光顯微鏡(日本Olympus)；TDL-5M 冷凍離心機(四川蜀科儀器有限公司)；ACCUCHEK Integra整合型血糖儀(瑞士羅氏公司)。

1.2 實驗動物

Wistar 大鼠60 只，6 個月齡，雄性，體重200～240 g，購自(濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號[SCXK(魯) 2019 0003]，飼養(yǎng)于動物房，實驗前在裂隙燈下檢查，排除基礎眼部疾病。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、造模及給藥 60只大鼠隨機取12只作為正常對照組，其余大鼠腹腔注射STZ溶液(60 mg/kg)[7]，繼續(xù)飼養(yǎng)4 周后測定血糖并在裂隙燈下檢查晶狀體及眼底，以大鼠血糖≥16.7 mmol/L且晶狀體及眼底發(fā)生白內(nèi)障病理性改變視為造模成功，并將大鼠隨機分為白內(nèi)障組和木犀草素低、中、高劑量組，12 只/組。木犀草素低、中、高劑量組分別按照20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg[8]灌胃給予大鼠木犀草素，正常對照組及白內(nèi)障組給予生理鹽水，1次/d，連續(xù)12周[9]。

1.3.2 血糖水平測定 末次給藥24 h后，使用血糖儀經(jīng)鼠尾靜脈測定血糖水平，記為給藥后大鼠血糖水平。

1.3.3 晶狀體渾濁度檢查及評分 使用托吡卡胺滴眼液散瞳后，在裂隙燈下檢查晶狀體渾濁度，參考文獻[10]方法根據(jù)晶狀體渾濁程度分為5級，并按照1～5 級標準分別記為0～4 分，按照公式計算大鼠晶狀體渾濁度評分。大鼠晶狀體渾濁度評分=分級評分×各分級大鼠只數(shù)/大鼠總數(shù)。

1.3.4 晶狀體過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)水平測定

每組取6只大鼠，處死后取部分晶狀體，在組織勻漿器中研磨勻漿后，8 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，分別使用試劑盒采用鉬酸銨化學比色法測定CAT 水平，紫外比色法測定GSH-Px 水平，WST-8法測定SOD水平。

1.3.5 晶狀體病理學檢查 每組取6 只大鼠，處死后取晶狀體，固定于10%中性甲醛溶液中24 h，石蠟包埋后進行切片，厚度為5 μm，行常規(guī)HE染色。

1.3.6 晶狀體MEK mRNA、ERK mRNA水平測定 每組取6 只大鼠晶狀體，Beyozol 試劑提取總RNA 后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照定量試劑盒方法測定晶狀體MEK mRNA、ERK mRNA 水平，以GAPDH為內(nèi)參，結果采用2-ΔΔCt法計算。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.3.7 晶狀體MEK、ERK蛋白水平測定 每組取6只大鼠晶狀體，提取總蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，加入MEK、ERK及GAPDH兔單抗（1∶500）在4 ℃冰箱孵育過夜，然后在含吐溫磷酸鹽緩沖液中清洗30 min，經(jīng)羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育后，滴加顯影液，采用化學發(fā)光法并使用凝膠成像儀成像，量化分析蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 木犀草素對糖尿病性白內(nèi)障大鼠空腹血糖的影響

與正常對照組比較，白內(nèi)障組及木犀草素低、中、高劑量組大鼠空腹血糖水平升高(P＜0.05)，給藥前，木犀草素低、中、高劑量組大鼠空腹血糖水平與白內(nèi)障組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；給藥后，與白內(nèi)障組比較，木犀草素各劑量組大鼠空腹血糖水平降低(P＜0.05)，見表2。

表2 木犀草素對大鼠血糖水平的影響

表2 木犀草素對大鼠血糖水平的影響

與正常對照組比較，aP＜0.05；與白內(nèi)障組比較，bP＜0.05。

2.2 木犀草素對糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體渾濁度的影響

與正常對照組比較，白內(nèi)障組大鼠晶狀體渾濁度評分升高(P＜0.05)，與白內(nèi)障組比較，木犀草素低、中、高劑量組大鼠晶狀體渾濁度評分顯著降低(P＜0.05)，見表3。

表3 大鼠晶狀體渾濁度評分 分，

表3 大鼠晶狀體渾濁度評分 分，

與正常對照組比較，aP＜0.05；與白內(nèi)障組比較，bP＜0.05。

2.3 木犀草素對糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體CAT、GSH-Px、SOD水平的影響

與正常對照組比較，白內(nèi)障組大鼠晶狀體CAT、GSH-Px、SOD水平顯著降低(P＜0.05)；與白內(nèi)障組比較，木犀草素低、中、高劑量組大鼠晶狀體CAT、GSH-Px、SOD水平升高(P＜0.05)，見表4。

表4 大鼠晶狀體CAT、GSH-Px、SOD水平

表4 大鼠晶狀體CAT、GSH-Px、SOD水平

與正常對照組比較，aP＜0.05；與白內(nèi)障組比較，bP＜0.05。

2.4 木犀草素對糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體病理學的影響

正常對照組大鼠晶狀體未見明顯病理改變，與正常對照組比較，白內(nèi)障組大鼠晶狀體皮質(zhì)纖維紊亂，變性壞死，晶狀體腫脹，提示造模成功；與正常對照組比較，木犀草素各劑量組大鼠晶狀體病理學明顯恢復，見圖1。

2.5 木犀草素對糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體MEK mRNA、ERK mRNA水平的影響

圖1 大鼠晶狀體HE檢查結果(100×)

與正常對照組比較，白內(nèi)障組大鼠晶狀體MEK mRNA、ERK mRNA 水平升高(P＜0.05)，與白內(nèi)障組比較，木犀草素低、中、高劑量組大鼠晶狀體MEK mRNA、ERK mRNA水平降低(P＜0.05)，見表5。

2.6 木犀草素對糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體MEK、ERK蛋白水平的影響

與正常對照組比較，白內(nèi)障組大鼠晶狀體MEK、ERK 蛋白水平升高(P＜0.05)，與白內(nèi)障組比較，木犀草素低、中、高劑量組大鼠晶狀體MEK、ERK 蛋白水平降低(P＜0.05)，見圖2。

表5 大鼠晶狀體MEK、ERK mRNA水平

表5 大鼠晶狀體MEK、ERK mRNA水平

與正常對照組比較，aP＜0.05；與白內(nèi)障組比較，bP＜0.05。

圖2 大鼠晶狀體MEK、ERK蛋白水平

3 討論

糖尿病性白內(nèi)障是由于糖尿病患者血糖水平變化導致的血液滲透壓改變，進而引發(fā)的晶狀體功能及生理結構的病理性改變。目前研究認為糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機制與醛糖還原酶活性改變導致葡萄糖代謝等過程受阻有關，同時，維生素等微量元素的缺乏、紫外線暴露、缺氧等因素均是影響糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病的因素[11]。目前，國內(nèi)外臨床及藥物研發(fā)體系均未發(fā)現(xiàn)有效治療糖尿病白內(nèi)障的藥物，所以糖尿病白內(nèi)障藥物的研發(fā)仍是當前工作的重點。

木犀草素是來源于金銀花、紫蘇等多種植物中的天然黃酮類化合物，研究表明其對乳腺癌、結腸癌、呼吸系統(tǒng)感染、心肌細胞損傷等多種疾病均具有一定治療作用[12-13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素對視網(wǎng)膜病變等多種糖尿病并發(fā)癥均具有較好的療效，劉濤等[14]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠顯著抑制神經(jīng)細胞凋亡，阻止糖尿病腦梗死大鼠疾病惡化；魏達亨等[15]研究報道木犀草素能夠通過抑制炎癥因子的釋放減少視網(wǎng)膜色素上皮細胞損失，緩解碘酸鈉誘導的視網(wǎng)膜損傷；周亞男等[16]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能夠通過升高視網(wǎng)膜SOD、Nrf2、HO-1等水平，進而抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變進展；同時，Rooban等[6]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠通過抑制晶狀體氧化應激損傷，進而組織白內(nèi)障的進展。由此可見，木犀草素在糖尿病性白內(nèi)障治療方面具有一定的潛力。

CAT是組織細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的重要成員，其能夠分解體內(nèi)過剩的過氧化氫進而防止細胞氧化損傷[17]；GSH-Px能夠?qū)⒂卸镜倪^氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而避免過氧化物對細胞結構及功能的干擾及損害[18]；SOD 作為一種抗氧化金屬酶，在機體氧化和抗氧化的平衡中扮演著重要角色[19]。趙晟等[20]研究表明，糖尿病性白內(nèi)障患者體內(nèi)CAT、GSH-Px 及SOD 水平較血糖水平正常的白內(nèi)障患者明顯降低，表明CAT、GSH-Px及SOD水平在糖尿病白內(nèi)障的發(fā)病機制及新生血管病變中均起到關鍵作用；吳群等[21]報道了在糖尿病性白內(nèi)障患者初始期、腫脹期、成熟期及過熟期等各個病情進展期，患者體內(nèi)CAT、GSH-Px 及SOD 水平均降低，且CAT、GSH-Px及SOD水平隨著病情進展而降低。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組大鼠比較，糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體CAT、GSH-Px 及SOD 水平降低，給予大鼠不同劑量的木犀草素后，與糖尿病性白內(nèi)障大鼠比較，木犀草素各劑量組大鼠CAT、GSH-Px 及SOD 水平呈劑量依賴性顯著升高(P＜0.05)，提示木犀草素能夠呈劑量依賴性的緩解大鼠晶狀體氧化損傷，進而緩解大鼠糖尿病性白內(nèi)障進展。

MEK/ERK通路主要參與了細胞代謝及凋亡等過程，在外界炎癥因子及病毒等多種刺激因子的作用下，MEK/ERK通路被激活，將信號從細胞表面轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，進而影響相關信號的傳導。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MEK/ERK 通路的異常激活與白內(nèi)障等眼部疾病有關[22-23]。肖涵等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病性白內(nèi)障大鼠體內(nèi)ERK通路被過度激活，而抑制ERK 通路相關蛋白的過度激活則能夠降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，進而抑制白內(nèi)障進展；陽輝等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病白內(nèi)障模型大鼠體內(nèi)MEK 通路被過度激活，二十二碳六烯酸能夠緩解白內(nèi)障大鼠晶狀體狀態(tài)，改善胰島素抵抗系數(shù)，其機制可能與調(diào)節(jié)MEK通路有關；黃亞琳等[26]研究證實了MEK/ERK 通路的激活誘發(fā)白內(nèi)障大鼠疾病進展，晶狀體渾濁度升高，由此可見MEK/ERK 通路在糖尿病性白內(nèi)障大鼠的發(fā)生發(fā)展中起到關鍵作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體MEK mRNA、ERK mRNA及蛋白水平升高，給予大鼠不同劑量木犀草素后，與白內(nèi)障組比較，木犀草各劑量組大鼠晶狀體MEK、ERK mRNA 及蛋白水平呈劑量依賴性明顯降低(P＜0.05)，提示木犀草素能夠呈劑量依賴性的抑制糖尿病性白內(nèi)障大鼠MEK/ERK 通路的過度激活，進而改善了白內(nèi)障的進展。

綜上所述，木犀草素能夠改善糖尿病性白內(nèi)障大鼠的晶狀體病理學變化，抑制晶狀體氧化損傷，其機制可能與調(diào)節(jié)MEK/ERK信號通路有關。