TDRKH-AS1抑制miR-544a對肺癌細胞增殖、遷移侵襲的影響

周曉桐，陳海洋，蘇 鵬

（遼陽市中心醫院胸外科，遼陽 111000）

肺癌是世界上最為常見的一種惡性腫瘤，也是一種具有侵襲性的疾病，其發病率和死亡率高，嚴重威脅人類健康，如何降低肺癌發病、尋找更有效的治療手段是目前醫學面臨的重點和難點[1]。近年來，分子靶向治療在肺癌的臨床研究與應用中取得一定進展，成為肺癌治療的新方法。lncRNA 在肺癌組織中的異常表達參與了肺癌的進展過程，其可作為肺癌中分子標志物[2]。TDRKH 反義RNA1（TDRKH antisense RNA 1，TDRKH-AS1）是一種lncRNA，有研究報道，具有拷貝數改變的差異表達的TDRKH-AS1與肺腺癌患者的總生存期呈正相關關系，而拷貝數擴增與TDRKH-AS1 表達增加顯著相關[3]。TDRKH-AS1 在大多數結直腸癌患者中上調表達，并與其較差的預后密切相關；TDRKH-AS1可通過靶向激活Wnt 信號通路中的β-連環蛋白（βcatenin）促進結直腸癌細胞的增殖和侵襲；有望作為預后預測指標和潛在的治療靶標[4]。miRNAs 是一種新型腫瘤標記物，其可作為肺癌診斷和治療的靶點[5]。研究發現，miR-544a 可促進肺癌細胞的侵襲和轉移[6]。LEF1-AS1 可通過調節miR-544a/叉頭框轉錄蛋白P1（Forkhead box protein P1，FOXP1）軸促進肺癌的增殖和侵襲[7]。然而，TDRKH-AS1對肺癌細胞增殖、遷移侵襲的影響及其是否通過調控miR-544a 起作用還尚未可知。因此，本實驗旨在研究TDRKH-AS1是否通過調控miR-544a影響肺癌細胞增殖、遷移侵襲。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取遼陽市中心醫院胸外科2018年5月至2020年5月收治的肺癌患者30例作為研究對象，取其癌組織和相應的癌旁組織；距離癌組織邊緣2～5 cm 處切除的為癌旁組織。診斷標準符合2010年衛生部公布的《原發性肺癌診斷標準》。病例納入標準：（1）所有患者經臨床、影像學、病理檢測確診為肺癌；（2）所有患者術前未經過放化療；（3）所有患者病理資料完整。排除標準：（1）合并有其他癌癥的患者；（2）有心、肝、腎等其他嚴重的身體疾病的患者；（3）不同意采集組織標本的患者；（4）有家族腫瘤史的患者。30例患者中，男21例，女9例，年齡24～78 歲，平均（35.2±1.4）歲。本研究已取得本院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 材料 肺癌細胞A549（貨號：FE177，美國ATCC）；胎牛血清（貨號：10099-141，美國Gibco 公司）；RPMI-1640培養基（貨號：R1145，美國Sigma公司）；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（貨號：WE0149-RLU，北京百奧萊博科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（CCK-8）（貨號：40203ES76，上海翊圣生物科技有限公司）；Transwell 小室（貨號：3452）、Matrigel（貨號：356234）（北京優尼康生物科技有限公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：D0010，北京索萊寶科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液（貨號：LM-3201-1，上海聯邁生物工程有限公司）；BCA 試劑盒（貨號：XY-MY-0096，上海烜雅生物科技有限公司）。

1.3 細胞培養與分組 將肺癌細胞A549接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液中進行常規培養，將pcDNA、pcDNA-TDRKH-AS1 分別轉染至A549 細胞中，記為陰性對照（pcDNA）組、TDRKHAS1 過表達（pcDNA-TDRKH-AS1）組；將pcDNATDRKH-AS1分別與miR-544a模擬物及其陰性對照（miR-NC）共轉染至A549 細胞中，記為pcDNATDRKH-AS1+miR-NC組、pcDNA-TDRKH-AS1+miR-544a組。

1.4 qPCR 檢測TDRKH-AS1mRNA 和miR-544a 的表達水平 提取癌組織以及pcDNA組、pcDNATDRKH-AS1組細胞的總RNA，miRNA 和lncRNA分別按照專用試劑盒逆轉錄合成cDNA，其中miRNA 采用莖環法進行逆轉錄，具體步驟：取1 μL 總RNA（約1 μg）補水至5.1 μL，將其與4.1 μL 的逆轉錄體系（2 μL 5×逆轉錄Buffer，1 μL dNTP mix，0.2 μL 重組RNA 酶抑制劑，0.4 μL 高效逆轉錄酶，0.5 μL 特異性莖環逆轉錄引物）混勻，42 ℃1 h，95 ℃5 min；然后取cDNA 按照熒光定量PCR 試劑盒使用說明進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。TDRKH-AS1 和miR-544a 分別以GAPDH 和U6 為內參；TDRKH-AS1 上游：5’-GGACAGGAAGTCAAGGGACA-3’，下游：5’-GGAGTTGGAGGTTCCAGTGA-3’；GAPDH 上游：5’-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3’，下游：5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’；miR-544a 上 游：5’-ATTCTGCATTTTTAGCAAGTTC-3’，下游：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6 上游：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，下游：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’。

1.5 CCK-8 檢測細胞存活率 選擇“1.3”中4組細胞，按試劑盒說明書進行操作，酶標儀檢測450 nm處吸光度值（A）。細胞存活率(%)=實驗組A 值/空白對照組A值×100%。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數 取“1.3”項中4組細胞，制成1×103個/mL 細胞懸液，將其接種于6 孔板中，每孔100 個細胞，培養2 周后用PBS清洗，然后甲醇固定、吉姆薩染色，最后用低倍光學顯微鏡下計數＞50個細胞的集落。

1.7 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲細胞遷移 將“1.3”項中4組對數生長期A549 細胞以無血清培養基制備濃度為5×103個/mL 細胞懸液。Transwell 小室上室加入100 μL細胞懸液，下室加入含血清培養基500 μL。常規培養24 h后取出小室，用棉簽將上室中殘留的細胞輕輕擦去后，以甲醛固定細胞30 min，并滴加0.1%結晶紫染色15 min。然后采用倒置顯微鏡觀察計數。細胞侵襲實驗除用Matrigel基質膠包被Transwell小室上室外，其余與遷移實驗操作相同。

1.8 熒光素酶報告實驗檢測TDRKH-AS1 和miR-544a 的靶向關系 構建野生型和突變型基因靶點TDRKH-AS1 的熒光素酶表達載體WT-TDRKHAS1 和MUT-TDRKH-AS1，將其分別與miR-NC 和miR-544a 共轉染至A549 細胞中；按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.9 蛋白質印跡（Western blot）法檢測蛋白表達

提取“1.3”項中4組細胞總蛋白，用BCA試劑盒定量。所有蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜上，用5%的牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗（1∶800）置于4 ℃冰箱孵育過夜，加入二抗（1∶200）室溫培養1 h，加入化學發光試劑顯影，分析各蛋白條帶灰度水平，以GAPDH 為內參計算蛋白表達水平。

1.10 統計學方法 采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-544a 和TDRKH-AS1 mRNA 在 肺癌中的表達 用qPCR 檢測肺癌組織及癌旁組織中TDRKH-AS1 mRNA 和miR-544a 的表達水平，結果顯示，與癌旁組織相比，肺癌組織中TDRKH-AS1 mRNA 表達水平降低，miR-544a 表達水平升高（均P＜0.05），見表1。

表1 miR-544a和TDRKH-AS1 mRNA的表達

2.2 TDRKH-AS1對A549增殖、遷移侵襲的影響 將pcDNA-TDRKH-AS1 及pcDNA 轉染至A549細胞中，檢測細胞增殖、遷移侵襲情況，結果顯示，與pcDNA組相比，pcDNA-TDRKH-AS1組TDRKH-AS1 表達水平升高，miR-544a 表達水平降低，細胞存活率降低，克隆形成數減少，遷移侵襲細胞數減少（P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 TDRKH-AS1 對A549 克隆形成和遷移侵襲細胞數的影響

2.3 miR-544a能逆轉TDRKH-AS1對A549增殖遷移侵襲的影響 將pcDNA-TDRKH-AS1 分別與miR-544a模擬物及miR-NC轉染至A549細胞中，檢測細胞增殖、遷移侵襲情況，結果顯示，與pcDNATDRKH-AS1+miR-NC組相比，pcDNA-TDRKHAS1+miR-544a組細胞存活率升高，克隆形成數增多，遷移侵襲細胞數增多（P＜0.05），見圖2、表3。

表2 TDRKH-AS1對A549增殖、遷移侵襲的影響

表2 TDRKH-AS1對A549增殖、遷移侵襲的影響

圖2 miR-544a能逆轉TDRKH-AS1對A549克隆形成和遷移侵襲細胞數的影響

表3 miR-544a能逆轉TDRKH-AS1對A549增殖遷移侵襲的影響

表3 miR-544a能逆轉TDRKH-AS1對A549增殖遷移侵襲的影響

2.4 TDRKH-AS1 靶向miR-544a LncBase Predicted v.2 預測顯示，TDRKH-AS1 與miR-544a 具有互補的核苷酸序列，見圖3。miR-544a 與WTTDRKH-AS1共轉染的細胞熒光素酶活性低于miRNC 與WT-TDRKH-AS1 共轉染的細胞（P＜0.05），見表4。

2.5 A549中Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的檢測 將pcDNA-TDRKH-AS1 及pcDNA 轉染至A549 細胞中，pcDNA-TDRKH-AS1 分別與miR-544a模擬物及miR-NC轉染至A549細胞中，檢測相關蛋白表達水平，結果顯示，與pcDNA組相比，pcDNA-TDRKH-AS1組A549 細胞中Ki67、N-cadherin表達水平降低，A549 細胞中E-cadherin 表達水平升高（P＜0.05）；與pcDNA-TDRKH-AS1+miR-NC組相比，pcDNA-TDRKH-AS1+miR-544a組A549細胞中Ki67、N-cadherin 表達水平升高，A549 細胞中Ecadherin表達水平降低（P＜0.05），見圖4、表5。

圖3 TDRKH-AS1靶向miR-544a

表4 雙熒光素酶實驗

表4 雙熒光素酶實驗

圖4 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

表5 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

表5 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

與pcDNA組相比，*P＜0.05；與pcDNA-TDRKH-AS1+miR-NC組相比，#P＜0.05。

3 討論

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，現有治療手段雖取得一定療效，但急需針對基因突變的治療手段，近年來，新的靶點和新的靶向藥物的出現使分子靶向治療成為治療肺癌的新途徑[8]。而尋找新的特異性靶點，研發新的靶向藥物是目前靶向治療的關鍵。lncRNA 參與調控腫瘤的進展，其可作為抗腫瘤藥物新靶點，以lncRNA 為靶點開發抗腫瘤新藥將是未來抗腫瘤藥物研發的趨勢[9]。已有研究表明，TDRKH-AS1 拷貝數與肺腺癌患者的總生存期呈正相關關系，而拷貝數擴增與TDRKH-AS1 表達增加相關[3]，推測TDRKH-AS1表達增加可能與肺腺癌患者的總生存期呈正相關關系。本實驗結果顯示，肺癌組織中TDRKH-AS1 表達水平降低（P＜0.05），表明TDRKH-AS1在肺癌中可能作為抑癌基因起作用，與前人研究結果相吻合。此外，TDRKHAS1 可促進結直腸癌細胞的增殖和侵襲[4]。而TDRKH-AS1在對肺癌細胞生物學行為的影響尚不清楚。本實驗過表達TDRKH-AS1后可降低細胞存活率，減少克隆形成數和遷移侵襲細胞數，且降低了Ki67、N-cadherin 蛋白表達水平，提高了E-cadherin蛋白表達水平（均P＜0.05）。Ki67是細胞增殖核標志物，其高表達可反映細胞增殖增多；N-cadherin、E-cadherin 是上皮間質轉化過程中的標志分子，影響細胞遷移和侵襲。因此，過表達TDRKHAS1可抑制肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA 的失調與腫瘤的進展密切相關[10]。研究發現，miR-544a過表達通過下調AXIN2表達促進人骨肉瘤細胞增殖[11]。抑制miR-544a 可減少結直腸癌細胞HCT116的遷移和侵襲[12]。且miR-544a可促進肺癌細胞侵襲和轉移[6]。本實驗結果表明，肺癌組織中miR-544a 表達水平升高（P＜0.05），結合前人研究結果，miR-544a 可能參與肺癌的進展過程，且可能在肺癌中起促癌作用。研究表明，LncRNA對miRNA具有海綿吸附作用，從而參與腫瘤發生發展過程[13]。在肺癌組織和細胞中miR-544a表達上調；TINCR 充當競爭性內源RNA 下調miR-544a 抑制肺癌細胞的增殖和侵襲[14]。本實驗發現，TDRKH-AS1 靶向調控miR-544a。同時，過表達TDRKH-AS1 和miR-544a 后，A549 細胞存活率升高，克隆形成數和遷移侵襲數增多（均P＜0.05），表明miR-544a 過表達逆轉了TDRKH-AS1 對A549 細胞增殖、遷移、侵襲的影響。

綜上所述，過表達TDRKH-AS1 可能通過下調miR-544a抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。