上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院：應(yīng)用克隆豬技術(shù) 助力本地豬種“把根留住”

“民以食為天，豬糧安天下”。為加強(qiáng)我國地方豬遺傳資源保護(hù)，2019年6月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《國家級別地方豬遺傳材料采集保存工作實施方案》，擬采集制作61個國家級保種場、保護(hù)區(qū)內(nèi)豬精液、體細(xì)胞等遺傳材料，并建成國家級地方豬遺傳材料信息數(shù)據(jù)庫。上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所研究員張德福作為國家級地方豬遺傳材料采集制作技術(shù)指導(dǎo)專家之一，全程參與了此項工作，并帶領(lǐng)團(tuán)隊成功采集了上海地區(qū)三個國家級地方豬精液、體細(xì)胞、胚胎等組織，并于2020年10月送至國家基因庫永久保存。

一、“靜態(tài)保種”將打破時空限制，為傳統(tǒng)保種作補(bǔ)充

產(chǎn)地建設(shè)保種場、備份保種場依然是地方畜禽保種最有效途徑。從動物進(jìn)化的角度來看，地方物種需要在特定的時空環(huán)境中，進(jìn)行一代代延續(xù)性繁育，在完成物種基因傳承的同時順應(yīng)時代進(jìn)化。我國地方豬遺傳資源雖然豐富，但在外來豬品種蜂擁而至和自然災(zāi)禍的雙重夾擊下，部分地方豬品種已滅絕或瀕臨滅絕，傳統(tǒng)的活體保種方法抵御災(zāi)害能力有限，通過提取地方豬遺傳材料，并作冷凍保存是保護(hù)好本地豬種優(yōu)質(zhì)基因資源的最佳輔助手段，同時對地方豬遺傳材料冷凍保存能夠打破時空限制，在豬遺傳資源的保護(hù)中具有重要意義，可以作為傳統(tǒng)保種體系的有效補(bǔ)充。

以上海本地豬種為例，楓涇豬、梅山豬、沙烏頭和浦東白豬是上海本地四大名豬種。其中，浦東白豬作為我國惟一一個白色地方豬種，至今已有近200年歷史。2006年，浦東白豬入選《國家畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》，兩年后浦東白豬惟一的保種場被列入國家級保種場。因浦東白豬無保種備份場，在非洲豬瘟疫情的威脅下，整個品種始終面臨較大生物安全風(fēng)險。因此，通過采集精液、胚胎、體細(xì)胞，利用克隆豬技術(shù)保存其遺傳物質(zhì)，實現(xiàn)基因備份保種，也就是“靜態(tài)保種”，是浦東白豬有效的保種措施。

近年來，張德福帶領(lǐng)上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物胚胎課題組的研究人員，數(shù)次前往浦東白豬保種場，采集浦東白豬的遺傳材料，對浦東白豬做全方位遺傳備份，為今后分子育種提供更多素材。

隨著全市各區(qū)對保種工作重視度不斷提升，楓涇豬、梅山豬、沙烏頭等地方豬種的遺傳材料采集工作也在陸續(xù)推進(jìn)。目前，張德福團(tuán)隊陸續(xù)對上海地區(qū)地方豬品種和培育品種遺傳資料進(jìn)行了有效保存，已初步建立了上海白豬、梅山豬、浦東白豬等多個品種的冷凍精子庫、體細(xì)胞庫及相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。

二、克隆豬技術(shù)的突破為“靜態(tài)保種”奠定基礎(chǔ)

“靜態(tài)保種”技術(shù)包括配子和胚胎等細(xì)胞/組織的冷凍保存及人工輸精、胚胎移植和體細(xì)胞克隆等遺傳資源的使用技術(shù)，這些技術(shù)的發(fā)展水平直接決定了“靜態(tài)保種”成功與否。提取地方豬種的遺傳材料只是第一步，要真正完成遺傳，還需將這些遺傳材料應(yīng)用，將遺傳基因“寫入”胚胎，并植入代孕豬的輸卵管，同時成功孕育、產(chǎn)下帶有這些遺傳基因的仔豬，且仔豬成年后具有繁殖能力。張德福團(tuán)隊在2007年已成功掌握了該項技術(shù)，成了繼中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)科研團(tuán)隊之后，第三個實現(xiàn)“克隆豬”技術(shù)突破的團(tuán)隊。

1998年，上海市啟動克隆豬計劃。張德福帶領(lǐng)課題組人員每天都要趕赴屠宰場收集卵巢，緊接著進(jìn)行克隆豬技術(shù)工作。為了拿到第一手資料，課題組人員總是在夜里蹲點收集，白天進(jìn)行試驗。卵母細(xì)胞去核、體細(xì)胞植入、電激活融合、胚胎細(xì)胞成熟分裂，每一步都必須準(zhǔn)確無誤。與克隆牛或克隆羊相比，豬卵母細(xì)胞由于脂肪顆粒較多，顏色深，在顯微鏡下難以觀測到細(xì)胞結(jié)構(gòu)，克隆的關(guān)鍵環(huán)節(jié)“去核”難度較大，克隆胚的成活率較低。通過反復(fù)試驗，課題組最終取得技術(shù)突破，創(chuàng)新采用“紡錘體觀測系統(tǒng)”，去核干凈，克隆胚胎的成活率大大提高。

成功提取豬卵母細(xì)胞并去核是第一步。克隆胚體外培養(yǎng)10小時內(nèi)，必須植入母豬的輸卵管。此時，受孕母豬的身體狀況也至關(guān)重要，需要經(jīng)驗豐富的畜牧專家提早觀察判斷，從豬群中精挑細(xì)選出最佳的代孕母豬。

2001年，上海市科學(xué)技術(shù)委員會批準(zhǔn)立項《實驗用豬克隆育種平臺技術(shù)的建立和應(yīng)用》，課題組在實驗室里成功獲得克隆胚。2005年，上海市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會批準(zhǔn)立項《豬體細(xì)胞克隆技術(shù)的建立及其優(yōu)化》，使這一技術(shù)得到應(yīng)用。同時，胚胎課題組于當(dāng)年在國內(nèi)首次獲得豬超低溫胚胎冷凍后代，建立了豬精液毫升大管冷凍技術(shù)，為地方豬種種質(zhì)資源長期保存提供了有效的技術(shù)手段。2007年，凝聚著團(tuán)隊10年心血的第一頭克隆巴馬小型豬成功降生。

三、克隆技術(shù)的不斷進(jìn)階為“保種繁育”保駕護(hù)航

2010年，上海“克隆豬二代”成功誕生，一年后這頭大型克隆豬發(fā)育成熟，與種公豬自然配種后順利產(chǎn)下5只健康的小豬仔。二代克隆豬所選用的供體細(xì)胞已不再是胎兒成纖維體細(xì)胞，而是成年豬種耳朵上的普通細(xì)胞，這就意味著遺傳材料采集對供體豬本身已無多大傷害，這一技術(shù)性突破對當(dāng)下“靜態(tài)保種”有著重要意義。

基于兩代克隆豬，上海克隆技術(shù)平臺搭建成型。研究人員熟練掌握影響豬體細(xì)胞克隆效率的主要技術(shù)環(huán)節(jié)，建立并優(yōu)化了豬體細(xì)胞克隆技術(shù)，改進(jìn)了豬體細(xì)胞克隆的一些關(guān)鍵技術(shù)。克隆技術(shù)的不斷突破，最終服務(wù)的還是本地豬種的繁育保種。

保護(hù)好本地豬種的優(yōu)質(zhì)基因資源，助力本地豬“把根留住”，這要基于提取、保存技術(shù)的不斷突破。目前，豬精液冷凍保存技術(shù)已不斷完善，實現(xiàn)商品化生產(chǎn)。養(yǎng)豬場配種已無須實體種豬，購買試管豬精液即可，這樣一來，配種不再受地域限制，優(yōu)良種公豬的基因能擴(kuò)大遺傳范圍，大大提高育種效率與質(zhì)量。然而，豬胚胎和卵母細(xì)胞因含有較高脂肪比例，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)在冷凍、解凍過程受損發(fā)生不可逆損傷，且豬胚胎移植需采用微創(chuàng)手術(shù)，技術(shù)要求高，對母體傷害較大，目前未能實現(xiàn)大范圍推廣。未來，課題組人員將針對豬胚胎冷凍及非手術(shù)法胚胎移植技術(shù)進(jìn)行技術(shù)攻關(guān)，努力在胚胎提取與保存工作取得突破，進(jìn)一步提高“靜態(tài)保種”效率，以期做好優(yōu)質(zhì)豬種的保種繁育工作。