美國國家禽流感監測計劃
——第一部分：監測體系概述（三）

譯校│翟新驗 杜建（中國動物疫病預防控制中心）

王慧強（北京市動物疫病預防控制中心）

一、病例定義

在美國，全面必須報告禽流感（N A I）病例定義包括以下信息：主動和被動監測（國家監測單元），臨床和實驗室診斷標準，被動和主動觀察監測的實質內容就是識別臨床癥狀和大體病變，對可疑病例立即啟動進一步調查，并且快速有效地采取適當的防控措施（Kradel等，1986；Weaver等，2006），首發病例，實驗室確診是必不可少的。

1.臨床癥狀描述。臨床癥狀曾在本文件前面介紹過。早期發現可疑的臨床病例有利于及時采樣，并把樣品送至實驗室進行檢測，以確定發病或死亡是否由AI病毒的毒力毒株引起的。亞洲高致病性禽流感（HPAI）H5N1，具高死亡率和明顯的臨床癥狀。由于種類、年齡、性別、并發感染、毒株、飼養環境等因素不同，其他NAI H5/H7亞型毒株感染家禽引起的臨床癥狀和死亡率也會有所不同。家禽的消化、呼吸、神經、生殖或循環系統會受到影響，只有輕微或無臨床癥狀的家禽同樣有可能感染H5/H7亞型低致病性禽流感（LPAI）病毒，這種隱性感染只能通過有計劃的監測項目檢測出來。盡管某些HPAI病毒株和一些LPAI H5/H7亞型毒株不會表現出明顯的臨床癥狀，但是下面將要描述的幾個臨床癥狀也有可能預示著NAI疫情的發生。鑒于這些特征，被動和主動監測還要結合血清學監測。

2.臨床癥狀定義。除了實驗室檢測標準，臨床癥狀定義有助于正確診斷存在于商業養殖業、活禽交易市場體系（LBMS），如庭院養殖等非傳統家禽飼養系統中的NAI H5/H7亞型病毒。當出現臨床癥狀時，符合臨床癥狀定義通常是啟動下一步檢測的首要篩查方法。家禽感染NAI H5/H7亞型病毒后一般會出現一種或多種臨床癥狀和大體病變：叫聲變??；精神萎靡；結膜炎；產蛋量下降，產淺色蛋、畸形蛋或薄殼蛋；呼吸癥狀，如出現啰音、尖銳音，呼吸困難；共濟失調、歪頸等神經癥狀；采食和飲水量減少；雞冠和肉髯腫脹或壞死；頭和腿腫脹；腿皮下出血；肺里充滿積液和血液；氣管炎和氣囊炎；器官斑點狀出血（Easterday等，1997）；或是禽群出現如下的死亡情況（Weaver等，2006）：

商業雞：連續兩天，每1 0 0 0羽雞死亡超過4羽；商業蛋雞：連續兩天，死亡數量為正常情況的4倍（2～50周齡蛋雞日均死亡率0.5/‰，5 0周齡后日均死亡率0.75/‰），或超過3天產蛋率下降5%；商業火雞：每天每1000羽火雞死亡超過2羽；庭院養殖家禽：只要出現突發的產蛋量下降或者明顯的雞只死亡時都應予以調查。

依據病毒致病力，混合平養家禽可能會快速傳播并死亡，籠養家禽（如蛋雞、鵪鶉）其死亡進程可能會稍慢，通常超過10～15天（Swayne，2006）。

3.流行病學標準和限定條件。對一個病例定義，首先要明確監測群體，這是首要的標準，監測要限定于某一具有特殊流行病學特征的畜群、禽群或是養殖場所。通過行業、州和聯邦政府共同完成對商業、LBMS和庭院養殖禽群的監測。

商業家禽企業監測（包括許多獵鳥養殖場），主要通過國家家禽改良計劃（NPIP）項目開展；在全國雞肉理事會和國家火雞聯盟的倡議下，商業肉雞和肉火雞監測也要達到或是高于NPIP商業家禽監測的要求；LBMS監測主要在動植物衛生檢疫局（APHIS）和參與州的動物衛生機構共同合作下進行，聯邦政府設立的項目是為了加強和統一各個州的項目及輔助各州達到在LBMS預防和控制LPAI H5/H7的目標，各個州的監測計劃通常會高于APHIS的最低標準；非傳統庭院養殖家禽監測主要是各個州與APHIS合作完成。

4.實驗室診斷標準。亞臨床感染病例一般都要通過實驗室診斷進行確診，或者通過易感品種禽類的臨床癥狀、病理變化等做出判斷的臨床病例，需要通過一種或多種實驗室診斷方法來確認HPAI和LPAI。將樣品接種雞胚分離病毒，通過檢測血凝活性確定A型流感病毒的存在；通過血凝素和神經氨酸酶抑制試驗確定是否為H5/H7亞型；采用靜脈接種致病指數（IVPI）測定法鑒定是否為HPAI病毒分離株，通過靜脈接種4～8周齡雞，連續觀察10天，當IVPI值大于1.2或導致75%以上雞死亡，則判定該毒株為HPAI病毒株。如果接種雞只沒有死亡；測定血凝素前體蛋白（HA0）裂解位點堿基序列，從而判斷病毒是否有突變為高致病性的能力；如果毒株不符合HPAI診斷標準，則可把該毒株定義為LPAI H5/H7亞型病毒。

5.疑似。實時反轉錄聚合酶鏈式反應（RRT-PCR）在感染48小時后即可檢測到AI病毒（HPAI病毒感染24小時后）（Spackman，2006），以及抗原捕獲酶免疫試驗（AC-EIA）在感染1～5天后即可檢出（Gelb和Ladman，2006）。RRT-PCR方法檢測糞便樣品（泄殖腔拭子），相較于氣管樣品病毒分離的敏感性和特異性要低。

6.NAI病例分類?？梢刹±夯谂R床病例定義做出NAI初步診斷，并經各州的動物衛生官員和APHIS負責當地的獸醫會診；日常監測中，有或無臨床癥狀，但經實驗室檢測為陽性結果。

疑似病例：滿足可疑條件或以下任一判定標準的病例：活禽氣管或泄殖腔拭子（或糞便）；死亡禽只糞便或是器官組織混樣，器官組織包括氣管、肺、氣囊、腸、脾、腎、腦、肝和心，接種雞胚（世界動物衛生組織，2005）。感染7～10天后即可檢出抗體，臨床癥狀一旦出現的急性期血清樣品和7～28天恢復期血清樣品。

“邏輯”一詞源于德國哲學家黑格爾，是指事物發展的客觀規律。以我國扶貧歷史進程為背景，分析和認清土地扶貧的邏輯，是進一步了解赫章縣乃至貴州省國土系統扶貧政策，取得扶貧成效，提煉扶貧工作經驗，服務全國扶貧工作的重要理論基礎。

肛咽拭子或環境樣品（LBMS）：經瓊脂凝膠免疫擴散試驗（AGID）檢測出A型流感抗體，但無法解釋是否由疫苗造成的；隨后通過血凝抑制試驗（HI）鑒定H5/H7亞型病毒；經NPIP行政官批準的商品化A型流感抗原檢測劑盒檢測為陽性，確定為H5/H7亞型病毒（USDA）；通過RRT-PCR檢測出A型流感病毒RNA，并確定為H5/H7亞型病毒。

確診病例：經美國農業部國家獸醫實驗室（USDA NVSL）分離出A型流感病毒，并鑒定為H5或H7亞型（NAI）病毒，接下來確定其致病性（HPAI或LPAI H5/H7）。

7.報告要求。商業家禽NAI H5/H7感染，應按照APHIS獸醫備忘錄第580.4項“疑似外來動物疫病/新發動物疫?。‵AD/EDI）調查程序”和第565.14項“向OIE和貿易伙伴報告LPAI H5/H7”的要求進行報告。此外，各州的動物衛生官員和APHIS負責當地的獸醫共同在場時，州的動物衛生官員按照NAHRS和OIE指南，通過國家動物衛生報告系統（NAHRS）向USDA報告商業養殖場發生的NAI。

二、采樣方法

主動的實驗室監測包括定期對家禽及其生活環境（如禽舍）等進行采樣，檢測抗原或抗體的存在。主動的實驗室監測主要用于檢測沒有出現高死亡率的養殖場LPAI H5/H7流行情況，也可檢測H5或H7亞型病毒。當家禽中存在抗體時，實驗室監測方法是非常敏感的，一般在感染AI病毒7～10天后就可以檢測出抗體，幾個月后抗體水平下降。這些檢測是有價值的，因為在長達幾個月內，仍然能檢測到抗體。然后，當出現幾個毒株混合感染或者是病毒一直在禽群流行時，抗體檢測方法就不能區分哪個毒株或者該毒株是否為當前流行毒株。只要病毒仍在禽群中流行，抗原（病毒蛋白）檢測方法是敏感的。由于AI病毒排出期通常只有10天左右，所以處于流行階段時的檢測是較為敏感的，但隨著AI病毒排出逐漸減少，其抗原檢測敏感性也會下降。實驗室監測對發現HPAI是有限的，反而通過觀察病毒感染家禽所引起的典型而嚴重的臨床癥狀，更容易發現疫情。

與實驗室采樣檢測相比，采用更主動的觀察監視也是監測疫病的有效途徑。養殖者的利益和疫病防控效果、生物安全管理措施的執行是息息相關的，按計劃要求積極觀察生產禽群，從而發現特定的臨床癥狀并向服務人員和獸醫人員報告。主動的觀察監視和主動的實驗室監測一樣，都是依據制定的計劃安排開展，與實驗室主動監測相比，它具有的優勢是：更方便經常性地操作，例如在大型商業養殖場每天可以開展1～2次觀察監視，對于發現HPAI，這種主動觀察監視方式的優勢更明顯，便于啟動進一步調查和實驗室采樣。幾乎所有的大型商業養殖場都可以通過主動觀察監視發現多種疫病，包括出現疑似AI病毒感染臨床癥狀的疫病。其他養殖場所，如小規模但高價值的養殖場，庭院養殖戶也可以使用主動觀察監視的方法，但這一般沒有行業標準，也沒有切實可行的操作管理程序。

所有各類家禽業都應使用被動監測方法，及時向上報告可疑死亡或臨床癥狀病例。與主動的觀察監視不同，這不是一個連續、定期地按計劃執行的方法。自愿主動報告病例的情況可能會隨著養殖場戶、疫病意識、實驗室監測成本和禽群死亡率不同而有所不同。

根據國家禽流感監測系統（NAISS）描述的養殖場類型不同而采取不同的監測手段。主動的實驗室監測手段（如血清學或病原學檢測）多應用于大型商業養殖家禽，LBMS和高風險的候鳥，根據監測目標不同，采用不同的診斷檢測方法。

對遷徙中候鳥的主動實驗室監測，主要目的是防止亞洲HPAI H5N1傳入美國，對候鳥的監測多采用抗原檢測方法。

對LBMS中，用于生產的禽群多采用血清學的監測方法；對于在市場上出售存活時間比較短的禽類多采用病原學的監測方法；對市場場所采集環境拭子以檢測是否存在活的病毒。對所有病原學監測方法，最終都要確定是否為亞洲HPAI H5N1病毒。

對于大型商業養殖場中HPAI的監測，很大程度上依靠禽群死亡率報告做出判斷，在這些病例中，實驗室診斷方法的目的不是為了早期發現，而是為了確定是否為HPAI病毒及其亞型。

由于HPAI會導致高死亡率和具有快速傳播能力，主動的實驗室監測作為監測手段對于早期發現HPAI不是十分有效，除了對候鳥監測/檢測HPAI外，USDA采用的主動實驗室監測手段主要是用于發現LPAI H5/H7。

根據新的NPIP LPAI H5/H7防控指南，自愿參與者有責任向聯邦認可的實驗室提供一些檢測樣品，樣品來自不明原因引起的呼吸道疫病、產蛋量下降以及疑似禽流感引起的家禽死亡的病例。診斷監測活動按照NPIP對預防和控制LPAI H5/H7要求進行，是需要向國家獸醫部門報告的一種疫病。

血清樣品通過ELISA抗體檢測方法或AGID方法進行初步篩查；若經ELISA方法檢測為陽性樣品，則需再次通過AGID進一步確認。確認為陽性樣品之后則應進行下列調查，在該陽性樣品場重新采樣進行病毒分離，并將樣品送至USDA NVSL進行亞型鑒定和致病性測定。AI病原學RRT-PCR檢測方法用于檢測H5和H7亞型，但需要在聯邦批準的診斷實驗室開展。所有H5或H7亞型病毒都必須進行下一步致病性分析，以鑒定其是否為HPAI病毒株，例如亞洲HPAI H5N1。

主動實驗室監測采樣主要是由商業養殖者、聯邦與州政府之間合作完成，以下將會介紹一些采樣要求：不同的家禽業參與者，對其家禽的采樣方法會有所不同。例如，不是美國所有的州都有活禽交易市場，不是美國所有的州都有LBMS項目。另外，由于NPIP項目主要是由商業家禽養殖的48個州共同合作建立的，所以不是所有的養殖者都會參與NPIP項目；不同類型的家禽抽樣方法都建立在一定國家規定的最低標準基礎上（聯邦行政法規（CFR），第9卷，第145～147部分）。

每個州的項目都需要達到國家規定的最低標準，但可以選擇收集其他的相關數據。這里所描述和分析的只是最低標準；雖然在這些監測計劃中對檢測方法有規定，但不是每個參與實驗室都有權開展所有的檢測項目。所以，每個州的檢測方案并不是統一的，而是應考慮所在州的實驗室能否進行相關實驗活動；盡管在一些州LPAI H5/H7檢測項目已經獲得了通過，但針對商業肉雞采樣計劃所用的抗原檢測方法（RRT-PCR和ELISA抗原檢測方法），還未建立明確的最低標準。一些企業可能會選擇符合FSIS要求的方法進行屠宰前檢測，從而免去檢測成品。這些公司根據采樣計劃開展抗原篩查，如前CFR第9卷、第146部分，LPAI H5/H7自主控制方案，主要采用抗體檢測方法，肉雞應在屠宰前10天進行抗體檢測。

這份文件中沒有提及屠宰場監測的作用，因為對這種監測效果進行評定比較困難。然而，事實上幾乎所有的肉雞包括大型、小規模肉雞養殖場生產的肉雞都會在屠宰前經FSIS或國家檢驗機構檢測。如果家禽出現明顯的呼吸道感染癥狀，例如氣囊炎，依據疫病嚴重程度決定是否銷毀，養殖者被告知每批屠宰家禽損失率。對于高的病變或是銷毀情況，行業獸醫或服務人員還會對家禽的感染來源進行調查。