反向分子對接技術在中藥活性分子作用機制研究中的應用*

溫梓辰，張萬祥，吳 倩，楊玉佩，謝 謙，鐘 輝，盛文兵，彭彩云

（湖南中醫藥大學藥學院中醫藥民族醫藥物創新發展國際聯合實驗室/創新藥物研究所，湖南 長沙 410208）

在如今新藥研發的熱潮中，中醫藥已逐漸成為研究關注的焦點。然而，中藥具有多成分、多靶點的特征，導致中藥材的藥效物質基礎及其作用機制無法明確，從而阻礙了中醫藥的發展。目前，研究中藥材活性成分及其作用機制的主要方法有血清藥物化學方法、“譜-效”關系分析方法、藥效差示血清色譜法、分子生物色譜法等，但都無法清晰解釋中藥活性與療效的內涵。小分子活性化合物與靶點的相互作用并不一一對應，而且通過實驗方法預測單個化合物的靶標蛋白是一個耗時且昂貴的過程[1]，因此使用計算技術進行虛擬篩選成為前期實驗的有力工具[2]。反向對接技術是以小分子化合物為探針，通過空間和能量匹配在靶點數據庫中相互識別，按照匹配程度由高到低進行打分和排序，通過排序結果，在數據庫中篩選活性化合物潛在的蛋白靶點，以探索其作用機制和副作用等[3-4]。筆者從反向分子對接技術在蛋白靶點預測、作用機制闡明、中藥質量標志物篩選及反向篩選技術的組合應用等方面綜述其研究進展，以期為中藥復雜成分的現代化研究提供理論依據，并討論其優點和局限性。

1 反向對接在蛋白靶點預測中的應用

中藥具有化學成分多樣性和活性多樣性的特性，復雜的化學成分的協同作用使其作用靶點同樣具有復雜性和多樣性。因此，中藥預防和治療疾病的機制十分復雜，活性成分靶點的確認和表征具有重要意義[5]。對于植物治療學來說，尋找生物活性成分的分子靶點非常困難，而利用傳統的蛋白質組學分析和藥代動力學方法進行搜索又耗時費力[6-8]。采用虛擬篩選和其他計算方法預測分子靶點近年來成為熱點，在中藥的復雜活性成分研究上發揮了較好的作用。

單味中藥活性成分靶點預測的主要流程為：先確定活性成分的化學結構，隨后通過各大靶點數據庫進行反向篩選，最后對得分較高的結果進行分析。吳曉敏等[9]將龍須藤的兩種多甲氧基黃酮TMFA和PMFA作為研究對象，使用Pharm Mapper Server藥效團數據庫進行反向對接篩選，根據匹配結果進行打分，并按分數由高到低排序，然后選取有統計學意義的潛在靶點進一步分析，根據龍須藤的主要功效對其蛋白靶點涉及的疾病進行分類，發現DHODH和CTSK兩個靶蛋白是其治療類風濕性關節炎的相關靶點；同時篩選出了一些與心血管疾病和癌癥相關的蛋白靶點。而國內尚未發現關于這兩種成分對于心血管疾病及癌癥方面治療研究報道，這為龍須藤治療心血管疾病和癌癥的相關藥理研究提供了啟示。最后，結合其他生物信息學手段進行分析，初步預測了這兩種成分抗類風濕關節炎的作用通路，為龍須藤治療該疾病的分子機制提供了理論依據。人參屬藥材主要成分是人參皂苷（三萜皂苷），具有多種活性，但不同的人參皂苷的靶點亟待明確。PARK K等[10]以潛在藥物靶點數據庫（PDTD）為基礎，選取其中的治療性條目、添加激酶靶點和73個涉及20種與毒副作用相關的蛋白質構建靶標數據庫，結合Glide反向對接軟件對26種人參皂苷進行反向篩選，然后對篩選出的靶蛋白與人參皂苷進行相互作用分析。通過對人參皂苷與天然配體結合能的比較和對接結果進行聚類分析，發現了4種潛在的人參皂苷靶蛋白[按其相互作用強弱排列分別為絲裂原活化蛋白激酶1（MEK1）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲氨酸蛋白酶凝血酶和絲氨酸蛋白酶α凝血酶]和4個可能的副作用和毒性相關的靶點：乙酰膽堿酯酶，腸脂肪酸結合蛋白，Ⅱ和Ⅳ型碳酸酐酶，谷氨酸脫氫酶。BYLER K G等[11]以sc-PDB數據庫中的16 034個蛋白質靶點為潛在的藥物靶蛋白庫，編寫了一個python腳本對乳香二萜和三萜使用Molegro Virtual Docker分子對接軟件進行批量反向對接研究。結果顯示乳香二萜類化合物與乙酰膽堿酯酶、幾種細菌靶蛋白和HIV-1逆轉錄酶呈選擇性對接。通過對靶蛋白及其相互作用進行分析可知：乳香萜類化合物的優先對接符合乳香的傳統用途和已有的生物活性。丹參具有活血化瘀的功效，活性成分多種多樣，其中丹參醇A研究較少。陳少軍等[12]使用PharmMapper Server數據庫對丹參的活性化學成分丹參醇A進行反向篩選，預測其潛在作用靶點，根據Fit score由高到低的順序篩選出與疾病相關的前10個靶蛋白，對排名前3的靶蛋白即視黃醇結合蛋白4、醛糖還原酶和轉甲狀腺素運載蛋白進行了丹參醇A與靶蛋白藥效團匹配特征分析，并對丹參與這些靶蛋白的相互作用進行文獻研究，將可能性極大的靶點進行反向分子對接方法學驗證和正向分子對接驗證，驗證了方法的可行性和結果的可靠性，最后預測醛糖還原酶可能是丹參醇A的潛在靶蛋白之一。銀杏酸（GAs）為銀杏果實“白果”中的有毒成分。YU P等[13]以sc-PDB數據庫（version2013）中的9 283個蛋白質靶點為潛在的藥物靶蛋白庫，將5種GAs與其進行反向對接，結合The Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery（DAVID）數據庫構建“活性化學成分-靶點-作用通路”篩選得到4個有效的靶蛋白[過氧化物酶體增殖物活化受體（PPARA、PPARD和PPARG）和二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）]，并通過分子動力學（MD）模擬和MM/GBSA計算，證實了以上5種GAs都可以與DHODH在熱力學上緊密結合，可作為對抗白血病（AML）的治療劑或開發天然DHODH抑制劑的先導化合物。

反向對接技術不僅可以應用于單味中藥活性成分的靶點預測，還可以對中藥復方的活性成分靶點進行預測，從而為闡明中藥復方防治疾病的作用機制提供理論依據。如QIANG W J等[14]利用數據庫和文獻資料，建立了遠志散化學成分數據庫，通過反向分子對接預測潛在的靶點，構建了組分靶網絡，對阿爾茨海默病（AD）的靶網絡進行映射和分析，得到“活性成分AD靶”網絡。通過網絡分析篩選出關鍵目標，確定了3個關鍵靶點（COX-2、M-AChRM1和M-AChRM2）和1個重要靶點[乙酰膽堿酯酶（AchE）]。施學麗等[15]基于經方的“方證相應”理論，采用PharmMapper Server數據庫對桂枝湯相關活性化學成分進行反向篩選，根據匹配結果進行評分和排序，篩選出與桂枝湯調和營衛作用相關的潛在作用靶點，然后利用AutoDock Vina軟件進行正向分子對接模擬試驗，驗證匹配結果的可靠性，最后動物實驗的結果顯示桂枝湯調和營衛的作用機制與11β-HSD1有一定的相關性。這種以“方”的藥物活性成分為研究的出發點，使用反向分子對接技術尋找“方”所含活性化學成分的蛋白靶點，然后以動物實驗來進一步研究這些蛋白靶點與“證”的相關性，通過分析靶點蛋白在生物體內的活性作用來反推“證”的內在發生機制的研究方法也是一條較好的中藥復方研究途徑。

2 反向對接在闡明作用機制中的應用

對于中藥作用機制的闡明，反向對接技術發揮了不可忽視的作用。目前，反向對接技術對中藥活性成分作用機制的研究主要集中于抗炎作用機制、抗腫瘤作用機制等方面。有兩種主要的研究方法，一種是對炎癥通路上的蛋白靶點進行反向分子對接模擬或運用藥效團數據庫進行反向分子對接篩選，根據對接的小分子化合物與生物大分子結合的自由能由低到高進行排序。而活性化合物與靶蛋白的親和力高低是由自由能的量值所評價的，對接自由能越高，其親和力就越低，以此篩選出親和力較高的靶蛋白，并對其配體-蛋白分子復合物進行作用力分析。如徐佑東等[16]將大黃酸作為實驗研究對象，選取TLR4/NF-κB、P38、JAK2/STAT3 3條炎癥通路上的30個蛋白為靶標庫，運用AutoDock對大黃酸進行反向分子對接實驗，依據對接自由能由低到高進行排序，然后對分子復合物中親和力較高的靶標蛋白進行篩選，獲得3個具有高親和性的靶蛋白（P38、P13Kγ和JAK2），通過分析這3個靶蛋白在炎癥通路上的作用，認為大黃酸發揮抗炎作用是通過抑制炎癥通路上的靶蛋白，進而影響炎癥信號傳遞。獨腳金內酯近年被證明為一種植物中普遍存在的新型植物激素，具有多種生物活性。陳奕銳等[17]根據靶點蛋白數據庫構建原則，從NF-κB炎癥通路中選取了信號通路上的62個蛋白，使用PDB數據庫下載相關蛋白晶體結構的PDB格式，構建靶標蛋白數據庫，通過AutoDock Vina分子對接軟件，運用MS-DOS批處理腳本，將獨腳金內酯類似物GR24和靶點數據庫中的靶標蛋白進行反向分子對接實驗，最后以對接評分和對接構象的相互作用力分析為依據，反向篩選出3個親和力較高的靶標蛋白（PARP1、CK2和AKT）。結果表明GR24對這些靶蛋白具有競爭抑制的活性，這也為其抗炎作用機制的研究提供了指引。雖然對于這些藥物的研究出發點都是以其抗炎活性為基礎，但是最終結果卻都顯示了其抗腫瘤活性，因此也為其抗腫瘤活性的后續研究提供了參考。槲皮素廣泛存在于各種植物中，是天然的黃酮類化合物。張明波等[18]利用AutoDock Vina軟件將槲皮素與已知結構的抗腫瘤藥物的靶蛋白進行半柔性對接，并對槲皮素與靶蛋白分子復合物的結構氫鍵相互作用進行作用模式分析，按照其自由能由低到高選取-9.0 kcal/mol以下的靶蛋白，通過計算得到槲皮素對這些靶蛋白的抑制常數都達到了nmol/L級。這表明槲皮素與這些抗腫瘤靶蛋白具有較好的親和性，槲皮素的抗腫瘤作用是通過抑制二氫葉酸還原酶、二氫乳清酸脫氫酶和基質金屬蛋白酶-8等酶的活性來實現的。

犀角地黃湯的化學成分復雜，歐海亞等[19]將篩選出的活性成分用PharmMapper Sever進行藥效團匹配反向篩選，使用Cytoscape軟件和String數據庫分別構建“化合物-靶點-疾病”相關網絡和靶蛋白相對應基因的“蛋白互作”網絡，最后通過GO-BP功能富集及KEGG通路富集，對靶點蛋白的生物學過程和通路進行分析，揭示了犀角地黃湯治療疾病的可能作用及機制。中藥單體臭椿酮具有多種藥理活性，如抗瘧疾、抗病毒、抗腫瘤等。趙松峰等[20]使用PharmMapper數據庫篩選臭椿酮抗腫瘤的潛在作用靶點，利用KEGG數據庫獲取篩選出的潛在活性靶點的通路信息，并對其進行富集分析構建共表達網絡，最后使用Cytoscape軟件構建“化合物（臭椿酮）-蛋白靶點-作用通路-疾病”網絡圖，通過對其相關蛋白靶標和通路研究，發現這些靶點和通路主要集中于一些腫瘤通路。臭椿酮發揮抗腫瘤作用也是由于其對相關的信號通路的作用實現的，這些理論基礎為臭椿酮能夠作為治療多種腫瘤的潛在藥物提供了支撐。

3 反向對接在中藥活性化合物篩選中的應用

單味中藥或是復方都含有大量化合物，這給活性化合物確證帶來了難度。反向對接能對大量化合物進行篩選，從中選出有效的活性化合物。如蘇博源等[21]以凹葉木蘭和中緬木蓮中所提取的18種化合物為研究對象，使用Discovery Studio軟件中的Pharma DB藥效團數據庫為靶標數據庫進行靶標匹配，根據實驗目的去掉未與抗腫瘤靶標結合的化合物，進一步篩選出25組配體-受體的結合類型并對其進行全柔性對接分析和預測剩余化合物的藥代動力學與毒理性質。研究結果表明其中4種化合物具有較大抗腫瘤活性潛力。腫節風含揮發油、酯類、酚類、鞣質、黃酮等化學成分。林彤等[22]通過TCMSP等數據庫搜集腫節風的化學成分，應用CTD匹配靶點對應的疾病，采用Cytoscape構建和分析網絡，利用STRING進行靶點蛋白質相互作用（PPI）分析，通過Glue GO進行基因本體（GO）及KEGG通路富集分析，采用EMDOCK進行分子對接，最終篩選出22個腫節風活性成分，可作用于116個靶點治療18類疾病，確認了淫羊藿素、苯二甲酸等8種活性成分為腫節風的主要藥效物質基礎，ALB、EGFR、CASP3及MAPK8等為其關鍵靶點。

4 反向對接在中藥質量標志物篩選中的應用

2016年，劉昌孝院士提出中藥質量標志物（Q-marker）這一新概念后[23]，中藥質量標志物成為了中藥質量標準研究的前沿與核心，業內學者對中藥質量標志物的研究方法、研究模式和示范性研究等方面進行了廣泛的研究[24-27]。白鋼等[28]以中藥質量標志物為切入點，嘗試構建中藥材品質的近紅外智能評價體系；李小錦等[29]提出了以臨床藥效為基準，建立質量標準體系的中藥質量生物標志物研究策略；侯小濤等[30]基于中藥一物多效的特點，以中藥相反功效的物質基礎研究為起點，對具有反向功效差異特點的中藥進行中藥質量標志物研究。而白鋼等[28]關于成分與藥效關聯研究的闡述，又為反向虛擬篩選技術應用于中藥質量標志物的研究提供了思路。李小錦等[29]提到采用反向分子對接與網絡藥理學相結合的方法對中藥質量標志物進行預測，這一思路和白鋼等[28]關于成分與藥效關聯研究的闡述相互印證。具體研究是通過文獻檢索對中英文文獻中與研究對象相關的活性成分進行篩選，然后利用PharmMapper藥效團數據庫進行反向找靶，預測所搜集的中藥活性成分直接作用的靶點。對篩選出來的靶蛋白進行功能注釋，再根據靶蛋白功能對相應的活性成分進行分組，將所分得的化學物質組與藥效進行關聯性研究，篩選出與藥物關鍵功能相關的直接作用靶點。最后，將獲取的靶點蛋白信息導入DAVID數據庫中，通過KEGG-Pathway功能預測靶蛋白的作用通路，對通路進行富集、注釋和分析，并構建“藥材-活性化合物-靶點-通路-疾病”作用網絡，初步預測質量生物標志物的范圍后，針對所篩選的關鍵藥理作用進行動物模型驗證實驗，經過分組、造模、給藥后對動物的脂肪組織和肌肉組織中相關蛋白表達進行測定與分析，初步得到藥物藥效功能相關的質量標志物。

5 反向對接與其他方法組合應用

計算機輔助藥物篩選方法和傳統藥物篩選過程對比，可以避免傳統方法篩選的盲目性，具有較好的主觀性和高效便捷的特性。近年來，反向分子對接組合其他方法進行目標預測的趨勢緩慢上升，尤其是使用反向對接系統和反向藥效團映射的反向篩選方法變得非常重要[31]。主要有以下3種組合方法。

5.1反向藥效團匹配和正向分子對接方法 綜合反向篩選與正向對接的結果，可以更精確、更嚴密地確定潛在靶點。周域等[32]運用PharmMapper藥效團數據庫對蒼術酮進行反向篩選，按照蒼術酮與藥效團的契合程度進行評分。將評分排在前10的靶標蛋白的生理作用進行分析，對具有疾病治療價值的前3個靶標蛋白與蒼術酮的藥效團匹配特征進行詳細描述，最后對3個靶蛋白進一步進行正向分子對接驗證。反向篩選和正向對接的結果可預測到細胞維甲酸結合蛋白2、二肽基肽酶Ⅳ和維甲酸β受體是蒼術酮的潛在蛋白靶點。

5.2 雙重虛擬篩選法 篩選邏輯由算法組成，單一篩選體系可能出現錯誤或遺漏，多個篩選系統結合使用，可使篩選結果更加可靠。BHATTACHARJEE B等[5]在尋找潛在靶點的過程中，采用基于idTarget和PharMapper的雙重虛擬篩選系統，從2個獨立的反向篩選平臺上獲得一組與多種癌癥相關的靶蛋白，并根據擬合得分和結合能進行排序，確認了靶點并揭示了其抗腫瘤作用機理。最后，通過對藏紅花苦素與Hsp90α在AutoDock中的對接后結合模式進行分析，驗證了結果的有效性。

5.3 反向篩選與傳統分子/細胞生物學結合 傳統分子/細胞生物學技術擁多種優勢，與反向對接技術結合，可使預測結果更加可信。CAI J H等[33]提出反向對接結合生物檢測和結構生物學的方法，以抗幽門螺桿菌篩選中發現的活性天然產物為探針，采用反向對接法搜索內部潛在藥物靶點數據庫（PDTD），然后進行同源性研究和酶法檢測。結果表明抗幽門螺桿菌肽去甲酰化酶（HpPDF）是篩選新的抗H.pylori藥物的潛在靶點。利用上述方法，對于小分子化合物的靶標篩選來說，無疑提高了其匹配的準確性和加強了結果的可靠性。

5.4 反向對接技術與網絡藥理學結合應用 反向分子對接技術結合網絡藥理學研究從整體出發通過多成分、多靶標、多途徑的研究模式構建“成分-靶點-通路-疾病”關系圖，可反映中藥作用機理，充分體現了中醫用藥的整體性，無論是在單方還是復方作用機制的研究都有較為廣泛的應用。如汪艷平等[34]通過PharmMapper藥效團數據庫反向篩選出瑤藥四方藤的潛在作用靶點，運用DAVID數據庫中的KEGG-Pathway功能，根據潛在的靶蛋白落在通路上的數量預測其作用的信號傳遞通路，并構建“藥材（四方藤）-活性化學成分-靶點-作用通路”網絡圖，通過對四方藤主要作用通路的分析，發現了與其抗炎作用相關的4條途徑，提示四方藤抗類風濕關節炎的作用機制可能是其活性成分通過干擾體內炎癥通路，進而影響炎癥介質的產生，達到治療效果的。

6 討 論

反向分子對接技術在藥物的研究與開發領域具有減少成本、節約時間和提高研發成功率等優勢，這為篩選藥物潛在作用靶點，探索作用機制，以及預測中藥質量標志物、活性分子等方面提供了新思路，是研究中藥復雜體系物質基礎和作用機制的重要方法之一。盡管反向對接技術具有一定的可靠性，但計算機模擬對接的結果不能完全代替體內實驗，同時還存在一些缺點，如各類軟件的運算方法不同，其結果均存在一定比例的假陽性；另外，蛋白質數據庫數據不完整，蛋白晶體結構解析進展緩慢都會使得結果不夠完整和準確；最后，評價方法的不夠完善，最終結果還需要與其他實驗方法的結果相結合進行進一步分析，以及通過體內外研究對目前已鑒定的靶點進行生物學實驗驗證。因此，面對著中藥單一成分多靶點，組方更是復雜多變的特性，反向分子對接技術顯示出了很大的優勢，在中藥活性化學成分蛋白靶點的預測、作用機制的深入研究及功效和生物質量標志物的確定上具有很大的發展空間。如能在蛋白數據庫的擴容、對接軟件和解析功能的優化、評價體系的發展等方面不斷完善，隨著反向分子對接理論和技術上的不斷完善，反向分子對接技術必將為科學、高效地闡明中藥活性分子及其作用途徑提供有力工具。