針灸療法調控microRNA在基礎實驗中應用的研究進展*

班維固，滕秀英，齊 輝

（黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001）

關于針灸治療機制的研究日益成熟，在國內外有著廣泛的文獻報道，針灸發揮治療作用的機制被認為可能與局部微創、軸突反射、脊髓節段支配、腦內整合及腦輸出等五級效應途徑相關[1]，其作用機制復雜多樣，仍需進一步探索驗證。近年來，關于microRNA研究越來越廣泛，其可參與各種各樣的調節通路，包括發育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等，有研究嘗試從調控microRNA角度探討針灸治療的作用機制。本文綜述了關于針灸調控microRNA在基礎研究中應用的研究進展，以期為針灸的治療機制研究提供新思路。

1 microRNA功能及作用方式

microRNA（miRNA）是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉錄后基因表達調控。到目前為止，在動植物及病毒中已經發現有28 645種miRNA分子[2]。大多數miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在于基因組中。此外，miRNA是一類內生的小分子RNA，其在細胞內具有多種重要的調節作用。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNA也可以調節同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過1個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來精細調控某個基因的表達[3]。據推測，miRNA調節著人類1/3的基因。最近的研究表明，大約70%的哺乳動物miRNA是位于TUs區（transcriptionunits，TUs），且其中大部分是位于內含子區。一些內含子miRNA的位置在不同的物種中是高度保守的。miRNA不僅在基因位置上保守，序列上也呈現出高度的同源性，miRNA高度的保守性與其功能的重要性有著密切的關系。miRNA與其靶基因的進化有著密切的聯系[4]。

近年來，miRNA對基因表達的調控已成為各疾病研究中特別關注的問題。miRNA為由18～24個核苷酸組成的非編碼RNA，與靶mRNA的3'UTR處的種子序列結合，從而抑制蛋白質表達。單個miRNA可以與各種mRNA相互作用，單個miRNA可以由復雜miRNA-mRNA網絡中的多個miRNA調控。miRNA表達失調被認為是各種人類疾病中的常見事件，miRNA失調涉及的疾病包括腦卒中、心力衰竭、腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎、慢性疲勞綜合征、阿爾茨海默病[5]等。因此，miRNA具有雙向作用，使其成為潛在的治療或診斷靶標[6]。

miRNA的作用方式主要取決于它與靶基因轉錄體序列互補的程度，有3種方式：

第一種是切斷靶基因的mRNA分子——miRNA與靶基因完全互補結合，作用方式和功能與siRNA非常相似，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA都以這種方式發揮作用，靶基因mRNA斷裂后，無poly（A）分子的3’端加上多個U并很快降解，含poly（A）的分子能穩定存在一段時間（如擬南芥miR-171）。在植物中目前有1個miRNA和3個潛在的目標靶基因完全互補（這些scarecrow基因編碼潛在的轉錄因子），盡管還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標靶，這仍是第一次發現miRNA和其潛在的目標靶完全互補，也提示miRNA可能包含與siRNA類似的作用方式。

第二種是抑制靶基因的翻譯——作用時與靶基因不完全互補結合，進而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩定性，這種miRNA是目前發現最多的種類（如線蟲lin-4）。而在植物中極少數的miRNA通過此方式來抑制靶基因。

第三種是結合抑制——具有以上兩種作用模式：當與靶基因互補結合時，直接靶向切割mRNA；當與靶基因不完全結合時，起調節基因表達的作用[7]。針灸的多途徑、多表達方式與miRNA作用方式高度契合，因此可從動物實驗出發，探討miRNA的調控靶點，探討針灸治療疾病的作用機制，以豐富針灸的作用機理。

2 針灸調控miRNA在基礎研究中的應用

2.1 腦缺血再灌注

2.1.1 通督調神針灸法調控miRNA表達 針灸可通過調節不同的基因信號傳導通路發揮其作用機制，不同的針灸方法及穴位所調控的基因也不同，通督調神法以補益為原則，其機制以上調血清miRNA表達為主。鄭仕平等[8]采用通督調神針法治療腦缺血再灌注大鼠，將大鼠分為電針組、艾灸組、阿司匹林組、模型組及空白對照組，治療7 d后進行腦缺血再灌注，結果在24 h后，針刺可有效降低大鼠的神經行為學評分；針刺是通過調控miRNA-664的表達來降低腦組織基質金屬蛋白9的表達，達到治療目的；這被認為是針刺治療缺血性腦卒中的作用機制之一。鄭仕平等[9]采用通督調神針法治療腦缺血再灌注大鼠，將大鼠分為電針組、艾灸組、阿司匹林組、模型組及空白對照組，治療7 d后造模，在24 h后發現，與模型組比較，電針組及艾灸組大鼠miRNA-290和miRNA-494表達量均顯著增高；大鼠大腦中動脈閉塞造成的腦缺血可明顯改變miRNA表達，引發神經元保護，達到調控腦卒中目的；針灸可調控miRNA-290和miRNA-494的表達，降低水通道蛋白-4的表達量，減輕腦水腫。

2.1.2 針刺加亞低溫調控miRNA表達 針刺加亞低溫法可調控多個miRNA傳導通路，通過上調或下調其靶基因達到治療目的。何灝龍等[10]觀察了針刺加亞低溫對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側海馬組織miRNA歸屬通路影響，將造模成功的大鼠隨機分為針刺組、亞低溫組、針刺加亞低溫組及模型對照組，結果發現針刺組miRNA表達數量為16個、亞低溫組為7個、針刺加亞低溫組為23個，證實針刺加亞低溫組可明顯改善大鼠腦缺血情況，減少腦梗死面積，其機制可能與針刺調控多個miRNA傳導通路有關，包括p53通路、Calcium通路、Jak-STAT通路及Neurotrophin通路等。針刺可多途徑調控信號，達到保護神經元的目的。陳楚淘等[11]觀察了針刺聯合亞低溫對腦缺血大鼠腦組織相關miRNA表達影響，將造模大鼠隨機分為針刺組、亞低溫組、針刺加亞低溫組及模型對照組，結果發現針刺加亞低溫組大鼠神經功能缺損評分及腦梗死面積均明顯低于其余各組，且針刺組調控miRNA數量為16個，亞低溫組為7個，聯合組為23個，證實針刺可通過多途徑、多靶點調控miRNA表達，其調控miRNA數量越多，在改善腦梗死面積及神經功能評分上越好，但具體的調節機制仍需進一步研究。

有研究[12-14]探討了針刺聯合亞低溫對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織miRNA表達的影響，將造模大鼠分為針刺組、亞低溫組、針刺加亞低溫組及模型對照組，發現相對于模型對照組，其他3組均可降低腦梗死面積，降低miRNA-181表達，并認為針刺加亞低溫組作用機制是通過下調p38 MAPK通路上miRNA-181表達來實現的，針刺治療的機制與miRNA調控具有相關性。何曉婷[15]基于MAPK信號通路研究了針刺聯合亞低溫對腦缺血再灌注大鼠腦組織的影響，將造模大鼠隨機分為針刺組、亞低溫組、針刺加亞低溫組及模型對照組，發現相對于模型對照組，其他3組均可降低miRNA-29c在腦組織中的表達，下調缺血側海馬組織中Map4k4的表達。針灸調控機理是基于降低MAPK信號通路上miRNA-29c及其靶基因Map4k4的表達，以及上調miRNA-29c靶基因Fem1b的表達來實現的，為針灸治療腦缺血再灌注提供了另一種的方式。

2.1.3 針刺百會、足三里調控miRNA表達 針灸調控與經絡傳導有一定關聯，針灸選穴多依據經絡選穴。百會、足三里為補虛要穴，針刺百會、足三里可上調血清miRNA表達。徐虹等[16]觀察了針刺百會、足三里對腦缺血再灌注損傷大鼠miRNA-126表達的影響，將造模大鼠隨機分為針刺組、藥物組、模型組及假手術組，分別于再灌注損傷第1、3、5、7天測定miRNA-126表達，針刺組miRNA-126表達明顯高于藥物組，針刺可以提高miRNA-126表達，以出芽相關蛋白-1和磷酸肌醇3激酶調節亞單位作為作用靶點，減輕腦血管損傷。CHEN S H等[17]研究了針刺百會、足三里對腦缺血再灌注損傷大鼠miRNA-124表達的影響，將造模大鼠隨機分為模型組、針刺組和假手術組，分別于再灌注損傷第1、3、5、7天測定miRNA-124表達，并使用定量聚合酶鏈反應檢測血清miRNA-124表達。腦缺血大鼠血清miRNA-124表達水平顯著升高，模型組和針刺組大鼠miRNA-124的表達峰值均在第3天出現。針刺組在同一時間點miRNA-124的表達高于模型組，針刺大鼠百會和足三里可減輕腦缺血再灌注損傷，這與周圍血清中miRNA-124的表達上調，以及整合素β1和層黏連蛋白的下調有關。這些變化可能成為針刺緩解腦缺血再灌注損傷的機制之一。王富明[18]研究證實針刺足三里、百會對腦血管再灌注損傷大鼠腦組織具有保護作用，保護機制與調控miRNA-126表達有關。

2.1.4 電針預處理調控miRNA表達 電針刺激強度更大，可下調并抑制miRNA表達并激發信號傳導通路達到治療目的。劉曌宇等[19]研究了電針預處理對腦缺血損傷小鼠海馬神經元miRNA-223表達的影響，將造模小鼠隨機分為電針預處理組、模型組及假手術組，檢測miRNA-223表達情況，結果發現電針預處理組miRNA-223表達低于模型組，且神經功能評分顯著高于模型組，證實電針預處理改善腦缺血情況與抑制miRNA-223表達相關，其作用機制可能為下調miRNA引發突觸后膜上α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體下降，阻滯鈣離子經該受體進入細胞，進一步減輕毒性，減少腦缺血損傷。趙俊等[20]研究了電針刺激對抑郁大鼠海馬及中縫核miRNA-16表達的影響，將造模大鼠隨機分為電針組、藥物組、模型組及正常對照組，電針組大鼠miRNA-16表達低于藥物組、模型組，針刺治療腦血管病與調控miRNA表達高度相關。柳維林[21]基于miRNA介導突觸可塑性，進一步探討了電針對缺血性腦卒中模型大鼠學習記憶功能的影響及作用機制，研究發現電針治療可提高缺血性腦卒中大鼠的記憶學習能力，其作用機制為抑制腦卒中模型大鼠miR-219a的表達，上調靶基因蛋白激酶，促進下游環磷腺苷效應元件結合蛋白的磷酸化，從而促使學習記憶相關蛋白的合成，發揮治療認知障礙的作用。

上述研究中選用的百會、足三里為補虛要穴，通督調神法以補益為原則，針灸干預的作用機制均以上調血清miRNA表達為主。補虛與瀉實相對，但對于瀉實未見相關報道，仍需進一步探索以瀉實為原則，針灸干預對血清miRNA表達的影響。針灸調控miRNA是多途徑、多靶點、多通路的，這與經絡錯綜復雜的循行路線有一定關聯。

2.2 心肌缺血再灌注損傷 針灸調控miRNA保護心肌細胞是通過多通路、多途徑、多靶點實現的。針灸干預心肌缺血再灌注損傷的機制為調控部分基因表達上調，部分基因表達下調。這與經絡系統密切相關，經絡能調節人體的機能活動，使之保持協調、平衡。當人體的某一臟器功能異常時，針刺等治療方法可激發經絡的調節功能，從而使功能異常的臟器恢復正常。針灸治療心肌缺血多以補虛瀉實為治療準則，針灸調控miRNA基因的表達是補虛瀉實的作用過程。盧繼東[22]運用標本配穴取穴方法，研究電針對心肌缺血大鼠細胞凋亡miRNA的調控機制，選用心肌缺血模型大鼠作為研究對象，隨機分為標本配穴組、電針組、正常組及模型組，治療22 d后行熒光定量PCR法檢測大鼠心肌組織miRNA-133-3p、miRNA-133-5p、miRNA-1-3p、miRNA-486表達。研究結果表明，標本配穴組miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表達高于電針組及模型組，miRNA-1-3p、miRNA-486低于電針組及模型組，證實多個miRNA基因參與了心肌細胞凋亡代謝過程，“標本配穴”電針法通過調控miRNA-133-5p與Caspase-3、Aifm2之間的基因來防治心肌缺血，主要是上調miRNA-133-5p表達和降低Caspase-3、Aifm2表達達到治療心肌缺血的目的。柳培雨[23]基于miRNA-214/Ca2+信號通路研究了電針干預心肌缺血再灌注損傷大鼠的作用機制，將造模大鼠隨機分為假手術組、電針組、正常組，測定miRNA-214表達情況，證實電針可上調miRNA表達情況，抑制鈣離子和CypD等相關蛋白的升高，發揮保護心肌作用；同時將H9c2細胞隨機分為Sham組、氧糖剝奪組（OGD組）、氧糖剝奪+電針+miRNA-214沉默組（miR-NC組）、氧糖剝奪+電針+miRNA-214過表達組（miR-214組），發現miR-214組細胞凋亡情況及血漿乳酸脫氫酶水平、肌酸激酶活性、鈣離子水平均較低，因此電針可通過miRNA-214/Ca2+信號通路干預心肌缺血-再灌注損傷。盧繼東[24]探討了電針內關穴對心肌缺血大鼠細胞凋亡相關miRNA表達的影響，將造模大鼠隨機分為正常組、模型組和電針組，并檢測心肌細胞miRNA-133a、miRNA-133b、miRNA-208、miRNA-499的表達量，結果發現電針組miRNA-133a、miRNA-133b表達量高于模型組，miRNA-208、miRNA-499的表達量低于模型組，因此電針主要是通過上調miRNA-133a、miRNA-133b表達，下調miRNA-208、miRNA-499的表達，達到保護心肌細胞、減少心肌損害的目的。王華等[25]探討了電針不同腧穴對心肌缺血模型大鼠心肌細胞miRNA表達影響，將大鼠隨機分為電針內關組、標本配穴電針組、正常組及模型組，治療21 d后，檢測心肌細胞miRNA-1、miRNA-133、miRNA-208、miRNA-499的表達，結果發現標本配穴電針組miRNA-133表達高于電針內關組及模型組，而miRNA-1、miRNA-208、miRNA-499表達低于電針內關組及模型組，標本配穴電針和電針內關均可調控心肌細胞凋亡，保護心肌細胞，且標本配穴電針療效更為顯著。上調miRNA-133表達，下調miRNA-1、miRNA-208、miRNA-499表達，為針刺治療心肌缺血再灌注損傷大鼠的作用機制。

2.3 慢性疲勞綜合征 針灸調控miRNA治療慢性疲勞綜合征的機制主要為上調miRNA基因表達，通過多途徑抑制細胞凋亡，達到治療該病的目的。朱昕昀[26]研究了針刺對慢性疲勞綜合征認知功能障礙大鼠海馬miRNA-184表達的影響，發現針刺可明顯改善大鼠的認知障礙，提高學習及自主探索能力，認為可能與聽宮上調海馬中miR-184表達，激活海馬中5-羥色胺通路、抑制Caspase-3蛋白表達、進而抑制神經元進一步凋亡相關。楊蕾[27]研究認為慢性疲勞綜合征患者外周血中存在異常表達的miRNA，這可能與調節免疫炎癥反應、氧化應激反應和能量代謝等相關信號通路有關，進而調控慢性疲勞綜合征的發生發展進程。針刺治療可有效緩解患者疲勞程度，減少緊張或焦慮及注意力不集中等心理癥狀，這種效應機制可能與針刺下調miR-122表達等相關信號通路有關。

2.4 膝骨關節炎 針灸調控miRNA治療膝骨關節炎的機制為促進miRNA表達水平，調控信號通路，降低炎癥反應，抑制細胞凋亡。林道冠等[28]基于miRNA-30b-5p/TLR4/NF-κB軸，研究針灸干預膝骨關節炎大鼠的作用機制，發現單一針灸及聯合治療可促進miRNA-30b-5p的表達，降低TLR4這一作用靶點，降低炎癥因子，抑制膝關節細胞的凋亡，為針灸靶向治療提供了基礎。葉靜[29]研究發現針刺治療可有效緩解膝骨關節炎患者膝關節疼痛，改善關節活動功能，并發現膝骨關節炎患者與健康受試者血清外泌體miRNA的差異表達明顯，針刺干預能下調膝骨關節炎患者血清外泌體miR-1228-5p、miR-1296-5p、miR-3168的信號通路表達。針刺可能通過調控患者MAPK信號通路、細胞凋亡、細胞自噬及代謝等途徑,發揮治療作用。劉君偉[30]研究了溫針灸對兔膝骨關節炎軟骨組織的影響，溫針灸治療兔膝骨關節炎的機理可能是通過降低Bax、Caspase-3表達，上調Bcl-2 miRNA水平，抑制軟骨細胞凋亡，從而發揮治療作用。

2.5 炎癥性疾病 目前關于針灸調控miRNA的基礎研究中，以腦缺血再灌注損傷和心肌缺血再灌注損傷研究最為常見，除此之外尚有部分基礎研究以炎癥性疾病為主，如潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征、慢性萎縮性胃炎等。針灸可通過調控miRNA表達治療上述炎癥性疾病，降低機體炎癥反應，下調炎癥因子指標。這與經絡系統密切相關，經絡有感應刺激和傳導信息的作用。當人體的某一部位受到炎癥刺激時，刺激可沿著經絡傳入臟腑，使其發生相應的病理變化。病理反應通過經絡反應于體表。針刺可通過經絡感應和傳導功能作用炎癥部位，miRNA表達與經絡密切相關，調控miRNA表達可促進經絡的循行與傳導，達到治療疾病的目的。

2.5.1 潰瘍性結腸炎 針灸調控miRNA治療潰瘍性結腸炎，主要作用機制為上調結腸組織的miRNA表達水平。李毅等[31]研究發現miRNA及其靶基因在潰瘍性結腸炎病變發展過程中具有重要調控作用。顧沐恩等[32]研究發現，隔姜灸天樞穴對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織黏膜損傷具有一定的保護效應，這與結腸組織miRNA基因表達密切相關，尤其是miR-139-5p、miR-204和miR-184的表達有關。王倩[33]研究發現，艾灸關元、足三里可對結腸炎產生干預效應，其作用機制一部分是通過升高MUC2 miRNA和EGFR miRNA表達來實現的，其基因表達多為上調。這與虛則補之的治療原則相對應，所選穴關元、足三里為補益要穴。

2.5.2 腸易激綜合征 吳立斌[34]研究發現艾灸天樞、上巨虛對腹瀉型腸易激綜合征大鼠的腹瀉癥狀和結腸炎癥有明顯改善作用，這與結腸組織β-防御素-2及mRNA表達升高有密切關系。陸高[35]研究發現針刺可能通過調控腸易激綜合征患者體內miRNA的表達，間接調控下游蛋白分子的表達，從而改善腹痛等癥狀。其作用機制為調控針灸-miRNA-免疫調節、針灸-miRNA-神經系統保護、針灸-miRNA-細胞保護、針灸-miRNA-腫瘤抑制等通路，其miRNA表達通路為15個。

2.5.3 慢性萎縮性胃炎 黃艷等[36]研究發現，隔藥餅灸可不同程度地逆轉慢性萎縮性胃炎大鼠外周血清oxo3、Uba52、S100a1、Nod2的mRNA表達水平。羅淑瑜[37]研究發現熱敏灸能下調胃黏膜c-myc mRNA、survivin mRNA基因的表達，恢復胃黏膜細胞增殖與凋亡之間平衡而達到治療慢性萎縮性胃炎的目的。

2.6 睡眠剝奪 針灸調控miRNA改善睡眠剝奪是通過平衡miRNA表達實現的，由于下丘腦神經遞質失調引發失眠，針灸通過調控其信號通路保持平衡，改善睡眠。吳雪芬[38]運用針刺治療失眠大鼠，發現針刺能通過上調5-HT1a miRNA及下調5-HT2a miRNA表達實現鎮靜安神作用。郭鑫[39]研究發現針刺改善大鼠失眠與調節血清單胺類神經遞質含量和MT1-miRNA、MT2-miRNA的表達有關，通過下調MTI和MT2表達達到改善睡眠質量的目的。魏歆然[40]研究發現針刺百會、神門可以改善睡眠時間及睡眠潛伏期，提高VLPO區的Clock mRNA的表達量，達到鎮靜安神作用。郭保君[41]發現針刺調理蹺脈能夠有效縮短入睡潛伏期、延長睡眠時間，這與提高大鼠視交叉上核內Clock mRNA、Per2 mRNA相對表達量有關。

2.7 多囊卵巢綜合征 針灸調控miRNA治療多囊卵巢綜合征是通過平衡卵巢組織的miRNA表達、改善內環境實現的。研究[42]發現多囊卵巢綜合征患者的卵泡液、顆粒細胞、卵泡膜細胞及脂肪組織均存在特殊的miRNA差異表達譜，miRNA可以調節卵泡發育和激素合成，參與多囊卵巢綜合征的發生。林鸞[43]研究發現穴位埋線能夠明顯改善多囊卵巢綜合征大鼠生殖內分泌紊亂，促進卵泡正常發育和排卵，進一步降低大鼠雄激素水平，解除高雄激素血癥對miR-125b表達的抑制，使miR-125b表達上調，降低靶基因FSHR mRNA表達，進而促進卵泡的正常發育，達到治療疾病的目的。

3 總 結

針灸可通過調控miRNA表達，借助傳導通路的作用，達到靶向治療的目的，且miRNA表達數量越多，針灸可調控途徑越廣泛，針灸能通過多途徑及綜合靶向治療發揮其作用機制，達到治療疾病的目的。另一方面，針灸調控miRNA表達與經絡密切相關，經絡可聯系臟腑器官，通行氣血，濡養臟腑組織，miRNA基因通路可能作用于經絡上，發揮治療疾病的目的。同時根據針灸補虛瀉實的治療原則，miRNA基因表達上調與下調與其可能有一定相關性。

目前的研究多以基礎研究為主，研究內容多以心腦血管疾病為主，仍需進一步擴大基礎研究范圍。同時雖有關于針灸調控miRNA治療疾病的臨床報道[44-46]，但其樣本量小，仍需大樣本、雙盲的隨機對照臨床研究進一步驗證針灸調控miRNA的作用機制。