細胞融合誘導EMT并生成乳腺癌干細胞的研究進展*

趙志正，劉碩，林洪生

中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053

乳腺癌是目前全球女性發病率最高的惡性腫瘤。據美國癌癥學會統計數據顯示，2018年，全球新發乳腺癌病例210萬［1－2］，我國乳腺癌發病率也在逐年增長，且呈年輕化趨勢。遠處轉移是乳腺癌患者死亡的首要原因［3－5］。隨著對腫瘤轉移機制認識的不斷加深，越來越多的證據顯示，并非所有腫瘤細胞都具有轉移特性，腫瘤組織中小部分具有干細胞樣特性的細胞——腫瘤干細胞決定著腫瘤的復發轉移。腫瘤干細胞可以通過上皮間質轉化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）獲取強侵襲和遷移能力［6］。近期，腫瘤干細胞的產生和EMT的發生機制得以合理揭示。

研究發現，間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是干細胞的重要成員，來源于發育早期的中胚層［7］，具有低免疫原性和多能分化潛能，在組織工程、靶向治療和器官移植中應用廣泛［8－9］。同時，MSCs也具有向受傷組織和腫瘤組織遷徙的特性，參與腫瘤微環境的形成，其機制可簡單概述為以下幾個方面：其一，促進腫瘤的進展，如在肺鱗癌中分化為成纖維細胞，參與間質形成，同時，通過改變細胞形態和減少細胞連接促進肺癌細胞轉移［10－11］。且骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可與肺癌細胞融合，促進其侵襲和轉移［12］，而通過旁分泌促進腫瘤發展也是其重要機制之一［13］；其二，與之相反，也有相關研究證實，BMSCs可抑制肺癌A549細胞的增殖和侵襲，使細胞周期停滯，并誘導其凋亡［14］。故BMSCs在不同的癌種中可能起到相反的作用，然而大多數據來源于實驗研究，具體是由于癌種的不同還是微環境的改變，尚需進一步研究［15］。

最新研究發現，BMSCs可通過細胞融合和細胞侵入式死亡的方式產生雜合體［16］，而腫瘤細胞可與其間質中的“常客”——BMSCs發生細胞融合［17－20］，在這一過程中，BMSCs賦予腫瘤細胞“干性”，并給予其可編碼的間質表型基因，即發生EMT轉化，從而獲取高侵襲和遷移特性，最終發生復發轉移。

1 腫瘤干細胞是乳腺癌復發轉移的根本原因

干細胞具有自我更新與增殖分化能力。腫瘤干細胞理論認為，腫瘤組織中的絕大多數細胞增殖能力有限，不能自我更新，不會導致腫瘤的復發和轉移，而其中極少數細胞卻具有自我更新、多能分化、多藥耐藥及強大的侵襲和轉移能力，這極少數的細胞即腫瘤干細胞，是引起腫瘤復發轉移的根本原因［21］。隨著腫瘤干細胞不斷從腫瘤中被分離出來，這一理論已在多種實體瘤中被證實，故研究認為，腫瘤干細胞是腫瘤復發和轉移的“種子”［22］。研究發現，從人類乳腺癌組織原發灶和轉移灶中分離出的CD44＋CD24－／low細胞亞群具有腫瘤干細胞特性，此為乳腺癌干細胞研究的開始［23］，其后又建立了側群細胞、無血清培養等多種分選方法，相關研究也由此逐漸展開。

2 EMT是腫瘤干細胞獲取轉移特性的重要環節

EMT是指具有極性的上皮細胞轉化為間質細胞，并獲得侵襲和遷移能力的過程，上皮細胞在此過程中失去了細胞極性及與基底膜的連接，表現為N－鈣黏蛋白、波形蛋白和纖連蛋白等間質標志物表達上升，E－鈣黏蛋白、緊密連接蛋白Z0－1標志物表達下降，從而使其有能力脫離腫瘤主體，發生侵襲和轉移。EMT是腫瘤細胞局部浸潤和轉移的關鍵步驟［24－25］。

最新研究發現，分化的上皮細胞發生EMT后，向間充質細胞表型轉變，遷移和侵襲能力增強［26］，同時由于表觀遺傳學的改變，分化的上皮細胞可轉化為未分化狀態，不僅可以表達干細胞標志物，而且可以獲得干細胞樣特征，如自我更新、增殖能力增強，尤其是侵襲、遷移能力增強。同時，研究指出，腫瘤干細胞更易發生EMT［27］，從人乳腺上皮分離出的干細胞也表達EMT標志物，腫瘤干細胞中的多條EMT信號通路被異常激活，說明EMT和腫瘤干細胞之間存在直接聯系，共同促進腫瘤的轉移。然而，腫瘤干細胞發生EMT的具體機制缺乏較為合理的假說，直到近期才有重要發現。

3 細胞融合是乳腺癌細胞獲得“干性”特質及其發生EMT的根源

腫瘤干細胞的起源有多種學說，但均不能合理揭示腫瘤干細胞生成和EMT之間的關系。細胞融合是腫瘤細胞獲得高轉移活性的一種潛在機制，是指兩個或以上細胞融合為一個細胞的過程，在受精、胎盤形成、組織修復等過程中發揮重要作用［28－29］。實驗研究表明，腫瘤干細胞源于腫瘤細胞和BMSCs的融合，并已在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌中被證實［30－32］。BMSCs來源于骨髓，被創傷、腫瘤炎癥微環境或者術后組織修復過程中大量趨化因子誘導，進入腫瘤間質，并在炎癥微環境的不斷刺激下，與腫瘤細胞融合，進而產生初代腫瘤干細胞。在這一過程中，親代腫瘤細胞基因組賦予子代細胞成瘤特性，而親代BMSCs基因組賦予子代細胞干細胞表型、間質表型及高轉移活性，使子代細胞在具有干細胞特性的基礎上發生EMT［33］，同時伴有多種相關分子表達［34］。對于乳腺癌來說，啟動腫瘤干細胞的惡性侵襲特性，即會導致腫瘤的復發轉移。這一假說不但合理揭示了腫瘤干細胞的起源，并且闡明了這一過程中EMT的發生機制，是目前研究的重要發現之一。

4 Wnt／β－catenin信號通路是維持腫瘤干細胞干性及EMT的核心通路

多條維持干細胞干性的信號通路在腫瘤干細胞中被激活，根據腫瘤干細胞表面標志物的不同，其激活通路有所不同［35］。研究發現，Wnt／β－catenin信號通路在維持乳腺癌干細胞干性方面具有重要作用，前期研究也證實了該通路的作用，是中藥干預的有效通路［36－38］。

同時，研究發現，Wnt／β－catenin是調控EMT發生發展的重要通路，如采用基因敲除法干擾Wnt／β－catenin信號通路，能夠顯著影響EMT介導的腫瘤轉移病灶的發生，提示該通路在腫瘤轉移中具有重要意義［39］。因此可推測，Wnt／β－catenin信號通路在BMSCs與乳腺癌細胞相互融合產生腫瘤干細胞及發生EMT的過程中發揮著重要的調控作用。部分研究發現，干預乳腺癌中Wnt信號通路可調控腫瘤干細胞，同時抑制甚至逆轉EMT。抑制Wnt信號通路可使腫瘤細胞失去自我更新能力，并下調EMT相關基因的表達水平，逆轉EMT，從而抑制早期肺轉移［40］。因此，靶向干預該信號通路可能是控制乳腺癌復發轉移的重要手段之一。

5 中醫藥在BMSCs與腫瘤交互作用中的研究進展

目前，中醫藥相關研究仍集中于腫瘤微環境下BMSCs表型發生變化從而促進腫瘤復發、轉移方面，缺乏對兩者融合產生腫瘤干細胞的研究。研究發現，在體外共培養條件下，BMSCs可以向腫瘤相關成纖維細胞分化，在形態學發生變化的同時提高增殖能力，以黃芪多糖干預后，BMSCs發生細胞周期阻滯，生長周期減慢，同時，α－平滑肌肌動蛋白和成纖維細胞激活蛋白下調，在腫瘤微環境中維持了其穩態［41］。經典名方半夏瀉心湯及其拆方的含藥血清可誘導胃癌細胞共培養條件下的BMSCs細胞進入G1期，降低S期細胞比例，同時，全方組也明顯降低了c－MYC和端粒酶逆轉錄酶蛋白表達水平，預防BMSCs在腫瘤微環境中的惡性轉化，一定程度上說明了中藥組方的合理性和科學性［42］。對中藥自擬方研究發現，中藥復方扶正抑瘤方在腫瘤微環境中可下調細胞端粒酶活性，增強P53基因表達，中斷BMSCs向惡性細胞轉化的趨勢［43］。

雖然BMSCs在以上共培養體系中通過自身細胞形態的變化，發揮了促進腫瘤細胞復發和轉移的作用，但是其表型發生轉化的具體分子機制，尤其是與腫瘤細胞共培養發生惡性轉化的機制及是否保留了其干性特點，更深層次來說，BMSCs是否是通過細胞融合獲得的細胞表型的變化，中藥復方干預其惡性潛質的作用是否也是通過以上機制，仍是今后需進一步深入研究的問題。

6 展望

BMSCs在不同的癌種和細胞系中可能起到相反的作用。有研究認為，MSCs通過與腫瘤細胞融合降低了子代細胞的惡性侵襲和致瘤性，雜交細胞表現為生長抑制、凋亡增加和致瘤性降低等生物學特點［44］，如MSCs可在腫瘤間質中同肝癌細胞自發融合，但是會導致肝癌細胞的轉移能力下降［45］。BMSCs可以有效抑制肝癌細胞H7402、HepG2的增殖及β－catenin、Bcl－2、c－Myc、PCNA和生長素的表達［46］。同時研究提示，MSCs對腫瘤細胞增殖的抑制作用是由MSCs分泌的Wnt信號通路抑制蛋白dickkopp－1所介導的［47］。在癌前病變研究中發現，骨髓來源細胞（bone marrow－derived cells，BMDCs）可以同正常的和轉化的腸上皮干細胞發生融合，卻未導致腫瘤的發生。MSCs對造血系統和非造血系統來源的腫瘤細胞增殖均有抑制作用，且會抑制腫瘤細胞凋亡和細胞周期進程［48］。

總的來說，在特定的腫瘤細胞模型中，MSCs與腫瘤細胞融合可以抑制腫瘤的生長、轉移，尤其是乳腺癌，說明MSCs融合可能在臨床治療腫瘤上具有潛在的應用價值。因此，靶向干預細胞融合信號通路可能是從根本上解決乳腺癌復發轉移的重要手段之一。

前期拆方研究發現，中藥復方及單體成分通過作用于Wnt信號通路干預腫瘤干細胞的自我更新，抗腫瘤復發、轉移。同時，研究發現，采用西黃丸含藥血清能夠抑制Wnt信號通路，調控人肺癌干細胞增殖［38］。在腸癌中通過調控ZEB－1－SCRIB循環，調節E－鈣粘連蛋白、N－鈣粘連蛋白的表達，抑制EMT的發生［39］，說明西黃丸可能是通過Wnt通路干預腫瘤干細胞干性的同時，影響EMT的發生。通過對活血化瘀類中藥研究發現，該類藥物干預腫瘤干細胞依賴于轉錄因子表達及轉錄因子／凝血因子VIIa信號通路，從而抑制腫瘤轉移。總之，BMSCss和腫瘤細胞的融合是產生腫瘤干細胞及發生EMT的根源，而Wnt／β－catenin信號通路是其核心通路，在乳腺癌術后長期干預過程中，通過抑制由細胞融合產生的初代乳腺癌干細胞生成，調控Wnt／β－catenin信號通路，干預其干細胞“干性”，中斷甚至逐步扭轉EMT的發生，可從根源上控制腫瘤的復發轉移。