微調3號方調控巨噬細胞表型轉化對HT－29細胞侵襲能力的影響*

趙璐，倪依群，尤建良

南京中醫藥大學附屬無錫市中醫院，江蘇 無錫 214071

研究發現，長期處于慢性應激狀態的腫瘤患者，機體會釋放大量腎上腺素（epinephrine，E）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、皮質醇等激素至外周血中。其中，NE對機體免疫功能的影響已受到學者們的廣泛關注，作為一種經典的神經遞質，NE可通過β－腎上腺素能（β－adrenergic receptor，β－AR）信號通路改變腫瘤的生物學行為和腫瘤所處的微環境，提高腫瘤細胞的遷移和侵襲能力［1］。而長期反復應激會促使NE的釋放從而致使機體炎癥和免疫功能發生改變，甚而影響到個體健康狀態。無論是交感神經釋放的NE，還是自身受到脂多糖刺激后分泌的NE，都使巨噬細胞處于一個富于NE的微環境中。而在腫瘤微環境中存在兩類生物學特征完全不同的巨噬細胞，一類為發生經典極化（classical polarization）的M1型，另一類為替代極化（alternative polarization）的M2型，M2型巨噬細胞可抑制細胞免疫應答，促進血管生成因子、金屬基質蛋白酶、生長因子等的釋放，從而影響腫瘤的增殖與轉移［2］。

中藥復方制劑微調3號方（WD－3）為微調平衡理論的基本方［3］，我科前期大量的臨床及實驗研究證實，WD－3具有延長晚期腫瘤患者生存期，改善生存質量及抗腫瘤轉移的作用［4－6］，但其作用機制尚不明確。本實驗將觀察NE和WD－3藥物血清對巨噬細胞表型轉化及其對結腸癌細胞侵襲能力的影響，從而探討WD－3抗腫瘤轉移可能的作用機制。

1 材料

1.1 實驗細胞與動物人單核細胞白血病細胞（human monocyte leukemia cells，THP－1，細胞目錄號：TCHu 57）、人結腸癌細胞株（human colon cancer cell，HT－29，細胞目錄號：TCHu103），購自中國科學院細胞庫。

SPF級健康雄性SD大鼠20只，6月齡，體質量250～280 g，購自上海斯萊克實驗動物中心，許可證號：SCXK（滬）2012－0002，常規飼料喂養，自由飲食飲水。實驗方案經過南京中醫藥大學附屬無錫市中醫院倫理委員會審查。

1.2 藥物與試劑微調3號方（WD－3）由黨參、茯苓、豬苓、薏苡仁、白術、陳皮、枇杷葉等組成，為無錫市中醫醫院院內液體制劑｛蘇食藥監注［2005］401號，蘇藥制字204002111｝。RPMI－1640細胞培養基、DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美國Thermo Fisher Scientific公司，批 號：C22400500BT、11965092、R001100、10099141）；佛波酯（phorbol ester，PMA）、NE、青霉素－鏈霉素雙抗（美國Sigma－Aldrich公司，批號：P21120、A7257、V900929）；Anit－CD206抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs－4727RAPC）；Anti－CD64抗體、環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）ELISA Kit（英國Abcam公司，批號：ab93500、ab133051）；人白介素10（Human interleukin 10，Human IL－10）ELISA試劑盒、Human IL－12 ELISA試劑盒（美國R＆D公司，批號：S1000B、S1200）；IL－4、戊巴比妥鈉、水合氯醛（德國Merck公司，批號：SRP3093、P11011、47335－U）；磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer，PBS，北京索萊寶科技有限公司，批號：P1020）；基質膠（美國BD公司，批號：356234）；甲醇、結晶紫（國藥集團化學試劑有限公司，批號：YC－SJ06009、548－62－9）。

1.3 儀器7000型細胞培養箱（美國Napco公司）；SC2－4A1型二級生物安全柜（新加坡ESCO公司）；5427R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司，離心半徑：8 cm）；CKX41型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；800TS型酶標儀（美國BioTek公司）；LSRⅡ型流式細胞儀（美國BD公司）；353097型Transwell培養板、657638型Transwell小室（美國BD Falcon公司）。

2 方法

2.1 WD－3含藥血清制備20只SD大鼠按隨機數字表分為對照組和藥物組，每組10只。藥物組大鼠每天灌胃給予WD－3溶液2 mL，每日2次，對照組大鼠給予等體積生理鹽水，連續給藥5天，且第5日晨間給予當日一天劑量。末次給藥前禁食12 h，給藥2 h后，按2 mL·kg－1的劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉，大鼠麻醉后腹主動脈采血。采血后，根據《關于善待動物的指導性意見》，對大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉過量致死。血清靜置2 h后，5 000 rpm·min－1離心10 min分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22μm濾器過濾除菌并分裝，－20℃冰箱保存備用。

2.2 實驗分組及M2型巨噬細胞誘導分化將THP－1細胞置于含10%FBS、2 g·L－1碳酸氫鈉、100 U·mL－1青霉素－鏈霉素雙抗的RPMI－1640培養基中，放入37℃、5%CO2的培養箱中培養。取生長狀態良好、呈對數生長期的細胞，調整細胞密度為2×105mL－1，接種于6孔板中，每孔加入含200 nmol·L－1PMA的培養液4 mL，培養48 h，使其誘導分化成巨噬細胞。待巨噬細胞呈貼壁狀態，將巨噬細胞分為A、B、C、D四組，A、B組分別采用10%空白血清培養基和10%WD－3藥物血清培養基處理48 h，C、D組預先采用含10μmol·L－1NE的完全培養基培養24 h后，再分別使用10%空白血清培養基和10%WD－3藥物血清培養基培養24 h。之后A、B、C、D每組分別加入含10μg·L－1IL－4的培養液4 mL處理24 h，將巨噬細胞進一步誘導為M2型巨噬細胞［7］。

2.3 流式細胞術檢測巨噬細胞表面CD64、CD206的表達上述分組培養誘導的M2型巨噬細胞，經胰蛋白酶消化后PBS洗滌3次，調整細胞濃度至1×105mL－1，加入CD64－PE或CD206－PE抗體3μL，4℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞表型及比例。

2.4 ELISA檢測細胞上清液中IL－10、IL－12及cAMP的含量嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組細胞上清液中IL－10、IL－12、cAMP的水平。

2.5 共培養體系的建立及Transwell侵襲實驗

取1 g·L－1基質膠20μL鋪于Transwell小室底部，37℃培養箱靜置1 h，待基質膠凝固。在12孔板中放入Transwell細胞共培養小室，0.41μm PVDF膜分隔上下室。下室分別加入5×104個M2型巨噬細胞（上述2.2項下方法所得），上室加入2×104個HT－29細胞，建立非接觸式共培養體系。培養48 h后取出上室，將上室沒有穿膜的細胞擦去，將Transwell小室置于甲醇溶液中固定10 min，0.1%結晶紫染色，置于倒置顯微鏡下統計未穿膜的細胞，每組隨機選擇5個視野進行統計分析。

2.6 統計學分析采用SPSS 21.0統計分析軟件對數據進行統計分析，計量資料以平均值±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較，符合正態分布和方差齊性時，采用單因素方差分析；方差不齊進行對數轉換，方差齊后進行單因素方差分析；若轉換后方差仍不齊，則采用Kruskal－Wallis非參數檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 WD－3含藥血清對巨噬細胞表型轉化的影響

流式細胞儀檢測細胞CD64及CD206的表達發現，與A組比較，C組表達CD64及CD206的細胞百分比顯著升高（P＜0.05），提示NE可促進巨噬細胞向M2表型轉化；與C組比較，WD－3藥物血清干預后的D組表達CD64及CD206的細胞百分比顯著下降（P＜0.05）。提示WD－3藥物血清可減弱NE促進巨噬細胞向M2型表型轉化的能力。見圖1、圖2。

圖1 不同藥物處理組CD64的表達情況

圖2 不同藥物處理組CD206的表達情況

3.2 WD－3含藥血清對M2型巨噬細胞分泌IL－10、IL－12的影響與A組比較，C組細胞上清液中IL－10水平顯著增加（P＜0.05），而B組細胞上清液中IL－12含量顯著升高（P＜0.05），提示NE能促進巨噬細胞向M2型巨噬細胞發生轉化，而WD－3可促進巨噬細胞向M1型發生轉化。與C組比較，WD－3藥物血清對M2型巨噬細胞進行處理后，D組細胞上清液中IL－10的水平明顯下降（P＜0.05），提示WD－3藥物血清可減弱NE促進巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化的能力。見圖3。

圖3 各組細胞分泌IL－10、IL－12的情況

3.3 WD－3含藥血清對M2型巨噬細胞調控HT－29細胞侵襲能力的影響通過共培養體系的Transwell侵襲實驗發現，與A組比較，C組HT－29細胞的侵襲能力顯著升高（P＜0.05）；與C組比較，D組HT－29細胞的侵襲能力則顯著減弱（P＜0.05）。提示M2型巨噬細胞能提高HT－29細胞的侵襲能力，而WD－3藥物血清能夠拮抗M2型巨噬細胞的這一作用。見圖4。

圖4 各組HT－29細胞侵襲能力

3.4 WD－3含藥血清對M2型巨噬細胞cAMP的影響與A組比較，C組細胞中cAMP含量顯著升高（P＜0.05）；與C組比較，D組細胞上清液中cAMP含量顯著減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞cAMP表達情況 （±s）

表1 各組細胞cAMP表達情況 （±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05

組別 cAMP（ρ／ng·L－1） 組別 cAMP（ρ／ng·L－1）A *198.42±1.52 C 461.97±2.07 B △182.73±1.96 D 208.75±1.57

4 討論

在腫瘤的復發轉移過程中，巨噬細胞發揮著重要的作用。巨噬細胞廣泛分布于人體各個器官，是機體重要的一類表型可變、功能多樣的免疫細胞，易受不同微環境的影響被極化成功能不同的亞型。在腫瘤微環境中，巨噬細胞占腫瘤間質免疫細胞總數的50%以上，被稱為腫瘤相關巨噬細胞（Tumor－associated macrophage，TAM）。TAM是實體腫瘤間質的主要組成部分，在腫瘤間質中聚集，與腫瘤細胞分泌的大量趨化因子，如：巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M－CSF）、單核細胞趨化蛋白－1（monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1）、趨化因子CC基序配體3［chemokine（C－Cmotif）ligand 3，CCL3］、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素－2（angiopoietin－2，Ang－2）等相關［8－10］。TAM至少包括2種不同活化表型和功能特征的亞群，即M1型和M2型。其中M1型TAM主要由干擾素γ（interferon gamma，IFN－γ）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導，呈遞Ⅰ型免疫應答，是機體免疫系統的重要組成成員，通過分泌促炎性細胞因子，發揮殺菌和抗腫瘤作用。而M2型TAM則受腫瘤細胞或T細胞來源的IL－4、IL－13或糖皮質激素以及其他免疫復合物誘導而成，表達CD64、CD206等特征性蛋白分子，產生Th2型細胞因子，促進白細胞介素－10（interleukin－10、IL－10）的分泌，進而降低機體免疫系統的抗腫瘤活性。同時，M2型TAM能促進腫瘤新生血管的形成，從而有助于腫瘤的生長、浸潤及轉移［11－12］。由此可見，腫瘤微環境中不同類型的巨噬細胞從多方面廣泛參與腫瘤進程，而M2型巨噬細胞主要具有抑制殺傷性T淋巴細胞的作用，促進腫瘤免疫逃逸以及對當前治療的抵抗。在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的發生發展中，TAM均扮演重要的角色，因此，進一步闡明腫瘤細胞與巨噬細胞的相互關系，找到其促癌及抑癌作用的平衡點，對提高腫瘤的臨床療效具有重要的意義［13－16］。

研究表明，慢性應激可提高腫瘤組織和外周血交感神經遞質NE、E的水平，促進模型動物腫瘤的生長和轉移［17－19］。腫瘤組織包括結腸癌組織有交感神經分布，有β腎上腺素能受體表達，交感神經末梢釋放的兒茶酚胺局部可達到微摩爾水平，滲入及腎上腺髓質分泌入血的兒茶酚胺可達到納摩爾濃度［20－22］。

應激相關激素NE對機體免疫功能的影響已受到學者們的廣泛關注，長期反復應激導致NE釋放從而致使機體炎癥和免疫功能發生改變，甚而影響到個體健康狀態，提示交感神經系統與免疫系統間相互作用的緊密性和直接性。無論是交感神經釋放NE，還是自身受到LPS刺激后分泌NE，巨噬細胞均處于一個富于NE的微環境［22］。

腫瘤發生發展的整個過程也是腫瘤細胞與機體細胞相互作用的過程，當人體中原位癌基因被激活或抑癌基因被抑制時，可導致腫瘤的發生發展。在此過程中病人始終處于變動的不平衡狀態，表現為臟腑功能失調，氣血陰陽紊亂，津液運化失常，日久而成腫瘤。三焦為氣血津液運行通路，因中焦主化生氣血津液，所以位居三焦樞紐。中焦脾胃失調，則氣血運行不暢而生痰濕瘀血，氣血生化無源而正氣不足。因此，中焦脾胃在腫瘤的形成發展中具有重要的作用?；谝陨险J識，趙景芳教授提出“微調平衡理論”，認為腫瘤的治療應立足中焦脾胃，顧護后天之本。不斷追蹤某一時期機體所處的不平衡狀態，找到內在“失衡的關鍵點”，通過不斷調節人體內環境、調節腫瘤與機體免疫，使其逐漸達到一個相對的平衡狀態。WD－3由黨參、茯苓、豬苓、薏苡仁、白術、陳皮、枇杷葉等組成，其中黨參、豬苓為君，健脾益氣；白術、茯苓健脾除濕，以助運化；薏苡仁助白術、茯苓健脾滲濕，益以半夏化痰濕、補脾氣；陳皮芳香健脾醒胃；佐以枇杷葉降逆和胃。全方重在微調中焦脾胃之氣，調氣以化瘀，改善機體高凝狀態而無腫瘤脫落擴散之虞；健脾以化濕，使痰濕生成無源而達正本源清之目的；健脾以扶正，發揮正氣固攝作用而抑制腫瘤擴散轉移。通過平衡陰陽氣血而調動機體自身的免疫功能，達到抗腫瘤轉移的目的。我科前期研究發現，WD－3可顯著提高晚期腫瘤患者的生活質量、延長生存期，目前已作為院內制劑廣泛應用于臨床。研究發現，WD－3具有抑制小鼠S－180肉瘤生長的作用，抑瘤率達29%，與對照組比較有顯著性差異，并且能顯著提高細胞因子IL－2、IL－4、IFN－γ的水平，提示WD－3抗腫瘤轉移的可能機制在于調整機體的免疫狀態［23－25］。

M2型巨噬細胞可表達CD64、CD206等特征性蛋白分子，本實驗結果提示，將THP－1細胞進行NE預處理后，再進一步誘導分化，能顯著提高細胞CD64及CD206的表達，提示NE能促進巨噬細胞向M2型極化［26－27］。而經過WD－3藥物血清同時干預后，細胞CD64及CD206的表達均減少，提示WD－3能夠減弱NE調控巨噬細胞向M2型發生轉化的作用。本實驗同時發現，NE能夠促進細胞分泌IL－10，但并未對IL－12產生影響，同樣說明NE能促進巨噬細胞向M2型發生轉化，而WD－3能夠減弱NE的作用。進一步建立結腸癌—巨噬細胞共培養體系，觀察M2型巨噬細胞對結腸癌細胞侵襲能力的影響，結果顯示，在富集更多M2型巨噬細胞的條件下，HT－29侵襲能力得到進一步提高，而WD－3藥物血清可以顯著減弱NE促進巨噬細胞向M2型發生轉化的作用，從而減弱HT－29細胞的侵襲能力。相關研究證明，NE通過激活β－AR，引起Ga蛋白介導的腺苷酸環化酶的活化，在該酶的作用下，ATP轉化為cAMP，cAMP進一步通過下游效應系統調節細胞活動。本實驗同樣證實，NE可顯著提高細胞cAMP含量，并且進一步發現，WD－3能夠降低cAMP的生成。因此，WD－3是否通過β－AR信號通路發揮效應值得進一步研究。

綜上所述，WD－3可抑制巨噬細胞向M2表型轉化，從而減弱結腸癌細胞HT－29的侵襲能力。本結果將為進一步研究WD－3抗腫瘤轉移機制提供基礎，為腫瘤免疫治療提供理論依據。