SIGLEC15 在腫瘤微環境及免疫調節中的作用

陳宵鋌 關中

中山大學孫逸仙紀念醫院耳鼻咽喉頭頸外科，廣州 510120

腫瘤的發展和進展與周圍基質的改變同時發生。腫瘤細胞可以通過分泌各種細胞因子、趨化因子和其他因子來改變其微環境，從而使周圍細胞重編程，使它們能夠在腫瘤存活和進展中發揮重要作用。免疫細胞是腫瘤微環境的重要組成部分，在腫瘤的發生發展過程中有至關重要的作用。越來越多的證據表明，先天免疫細胞［巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞、先天淋巴細胞、髓源性抑制細胞和自然殺傷細胞（NK 細胞）］以及適應性免疫細胞（T 細胞和B 細胞）均存在于腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中。腫瘤細胞和周圍免疫細胞之間的互相作用最終會促進腫瘤生長和轉移。

腫瘤發生發展過程中會產生特定的因子，越來越多的研究發現這些因子可作為腫瘤免疫療法的新靶標。當腫瘤細胞表達腫瘤抗原時，抗腫瘤免疫周期開始。抗原呈遞細胞受到腫瘤抗原的刺激，并將抗原衍生的肽呈遞給免疫細胞，從而激活免疫細胞使其在循環中遷移，進入腫瘤部位并殺死腫瘤細胞。腫瘤細胞的死亡誘導了其他腫瘤抗原的釋放，從而引發了另一個腫瘤免疫周期［1］。免疫系統具有復雜的負反饋回路，以控制對病原體的免疫反應。腫瘤細胞利用這些負反饋回路逃避抗腫瘤免疫過程。當前的抗腫瘤免疫治療方法通過一些靶點并利用各種機制激活腫瘤免疫，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。

腫瘤免疫周期激活后，效應T 細胞會進入人體全身，滲入腫瘤細胞部位，識別表達主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）呈遞的腫瘤抗原衍生肽的腫瘤細胞，并殺死靶腫瘤細胞。腫瘤細胞的死亡誘導了其他腫瘤抗原的釋放，從而通過引發和激活更多的T細胞來識別和攻擊腫瘤細胞，進一步增強抗腫瘤免疫反應［2］。在任何免疫反應中，抗腫瘤反應的最終階段是由刺激性和抑制性輔助途徑的復雜網絡調節。其中程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）途徑是主要的抑制途徑之一。T 細胞受體（T cell receptor，TCR）與其相關抗原-MHC 復合物的結合，以及細胞因子刺激［例如白細胞介素（IL）-2］，誘導PD-1 的表達。PD-1 與PD-L1 在靶細胞上的結合會抑制T 細胞增殖和IL-2 的產生，從而減弱免疫反應。因此，合理的聯合免疫療法必須協同促進T 細胞活化和效應子功能，并協同拮抗抑制性T細胞。

在TME分類系統中研究腫瘤免疫力可以作為評估抗腫瘤免疫力和確定潛在的腫瘤免疫抵抗機制的第一步。TME分類基于兩個主要因素：（1）PD-L1在腫瘤中的表達；（2）免疫細胞浸潤的存在，主要是腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）［3-5］。相應地，TME有4種不同的亞型：T1（PD-L1-TIL-）、T2（PD-L1+TIL+）、T3（PD-L1-TIL+）和T4（PD-L1+TIL-）。目前腫瘤免疫療法主要有兩種方法：（1）增強法，通過增強“正常”抗腫瘤免疫機制從而達到抑制腫瘤發展的目的。這類方法的范圍從傳統的IL-2信號非特異性增強到最近的腫瘤特異性嵌合抗原受體T 細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）。（2）歸一化方法，其目的是在TME中恢復有缺陷的抗腫瘤免疫力，包括食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICI）和其他正在開發的藥物（例如腺苷途徑的抑制劑）［6］。目前在使用ICI 刺激免疫微環境和抗癌免疫反應方面取得的進展改善了患者的治療結果。然而，原發性和獲得性耐藥顯著降低了ICI的成功率，只有少數患者受益于目前可用的癌癥免疫療法。

在腫瘤發生過程中，腫瘤細胞呈現特定的碳水化合物鏈，這是癌癥免疫治療的新靶點。雖然這些腫瘤相關碳水化合物（tumor-associated carbohydrates，TACA）可以通過抗體和疫苗接種方法靶向識別，但包括唾液酸聚糖在內的TACA 能夠通過與白細胞上的免疫受體結合來抑制抗腫瘤免疫反應。唾液酸主要存在于與蛋白質或糖脂相連的N-連接和O-連接聚糖的非還原端。唾液酸化過度促進其與唾液酸結合受體［如選擇素和唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素（sialic acid-binding Ig-like lectins，SIGLECS）］的相互作用，從而促進癌癥進展。一系列稱為SIGLECS 的唾液酸識別蛋白（唾液酸+免疫球蛋白超家族+凝集素的縮寫）可在各種白細胞上表達，通過其細胞外結構域的配體及介導細胞內結構域的信號轉導來調節免疫應答［7］。大多數SIGLECS 與蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1相互作用以抑制細胞活化，而小部分SIGLECS 通過銜接蛋白DAP12（由TYROBP基因編碼）和酪氨酸激酶（SYK）發出信號，從而激活并使其表達。其中，SIGLEC15 屬于具有后者作用的亞家族成員。多個研究表明，SIGLEC15 在破骨細胞分化中具有重要作用，而最近其在腫瘤和微生物感染中的潛在作用也引起了研究者們的注意。本綜述將簡要總結目前與SIGLEC15 的生物學功能有關的工作，旨在為通過化學生物學方法鑒定SIGLEC15配體的研究提供理論基礎。

1 SIGLEC15分子性質及其在腫瘤免疫中的作用

2001 年Angata 等［8］首次報道了與SIGLEC15 的N 末端免疫球蛋白樣結構域相對應的人類基因組DNA 序列。SIGLEC15 具有由兩個免疫球蛋白樣結構域組成的細胞外結構域，其后是一個跨膜結構域，其中包含一個賴氨酸殘基（人SIGLEC15中的Lys274），它是與銜接子蛋白DAP12相互作用所必需的。DAP12 的細胞外結構域非常短（少于20 個氨基酸），其后是跨膜結構域，其中包含天冬氨酸殘基（人DAP12 中為Asp50），胞質尾部包含稱為免疫受體酪氨酸的活化基序（immunoreceptor tyrosine activation motif，ITAM）的序列基序，磷酸化后募集SYK。SIGLEC15與DAP12之間的相互作用是基于跨膜結構域上的離子鍵，類似于許多其他與DAP12相關的受體。

盡管研究中具有作用的聚糖結構非常有限，但有研究表明SIGLEC15優先結合唾液酸Tn（Neu5Acα2-6GalNAcα1）結構［9］。人SIGLEC15的聚糖結合活性遠弱于小鼠SIGLEC15的聚糖結合活性。SIGLEC15與銜接蛋白DAP12相關，并且在人工實驗系統中也顯示與另一銜接蛋白DAP10 弱相互作用；然而，后者發現的體內相關性尚不清楚。SIGLEC15 在人脾臟和淋巴結中表達DC-SIGN 的細胞子集中表達。這些發現表明SIGLEC15 可能在髓樣細胞中起作用，但是SIGLEC15的體內作用尚不清楚。

既往研究表明，與腫瘤相關的糖基化可以通過與聚糖結合受體（也稱為凝集素）結合而直接影響抗腫瘤免疫力［10］。在各種類型的腫瘤中均發現了高唾液酸化的聚糖結構［11-12］。某些腫瘤細胞上的唾液聚糖可與抑制性唾液酸結合受體SIGLECS結合［13-14］。SIGLECS屬于免疫球蛋白（I）型凝集素家族［15］。在人類中，有14 種具有功能活性的SIGLECS 受體。一方面，存在進化保守的SIGLECS 受體，包括SIGLEC-1、SIGLEC-2（CD22）、SIGLEC-4 和SIGLEC15。另一方面，與CD33相關的SIGLECS也已在哺乳動物內迅速進化。SIGLEC-3 （CD33）、SIGLEC-5、SIGLEC-6、SIGLEC-7、SIGLEC-8、SIGLEC-9、SIGLEC-10、SIGLEC-11 和SIGLEC-14 屬于CD33 相關的SIGLECS，對于它們中的大多數而言，它們在小鼠和人類中沒有直系同源物。大多數SIGLECS受體的細胞內結構域均含有基于免疫受體酪氨酸的抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM）或類似ITIM 的圖案。這些抑制受體的參與導致含有Src 同源區域的磷酸酶（SHP）-1 和SHP-2 的磷酸化，從而抑制細胞活化。大多數SIGLECS 受體在免疫細胞上表達，從而參與抑制免疫細胞的活化。CD33 相關SIGLECS 的多樣化可能是由于與病原菌的相互作用，這些病原體利用唾液聚糖覆蓋了抑制性SIGLECS 受體，從而利用抑制性SIGLECS受體［16］抑制細胞活化。

SIGLECS 受體作為新的靶向免疫檢查點的作用最近得到了深入的研究。先天免疫細胞上抑制性SIGLECS受體的表達與抗腫瘤免疫有關。SIGLEC-7 在腫瘤細胞上表達。大多數NK 細胞和SIGLEC-9 可以在NK 細胞的某些亞群中找到。唾液聚糖在腫瘤細胞內的上調可以通過與SIGLEC-7 以及在某些情況下與SIGLEC-9［17］結合來抑制NK 細胞介導的腫瘤細胞殺傷。已有研究發現SIGLEC-9的表達使巨噬細胞極化偏向于致瘤性表型，并在巨噬細胞上增加了PD-L1的表達［18］。在此實驗組中，SIGLEC-9的參與依賴于STn 修飾的粘蛋白。小鼠中的其他實驗表明，髓系極化受抑制性SIGLECS 受體的影響，包括SIGLEC-E（SIGLEC-9在小鼠中的功能旁系同源物）［19］。

SIGLECS 在包括CD8+T 細胞在內的適應性免疫細胞上的表達抑制有效的抗腫瘤免疫。SIGLEC-9 在包括非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）、結腸直腸腫瘤、上皮性卵巢腫瘤和黑色素瘤在內的多種腫瘤中的腫瘤浸潤T細胞上調［20］。在T細胞上過表達SIGLEC-9的轉基因小鼠模型中，腫瘤生長顯著增強。SIGLEC-9主要在腫瘤特異性T細胞上表達，表現為浸潤腫瘤的CD8+T細胞中的TCR成分減少［21］。SIGLEC-9 陽性CD8+T 細胞代表功能障礙的腫瘤內T細胞亞型，而SIGLEC-9阻斷劑可以使其重新激活。

SIGLEC15 可識別的唾液酸-Tn 結構，是一種眾所周知的與腫瘤相關的碳水化合物抗原。巨噬細胞在腫瘤免疫中起著主要作用［22］，SIGLEC15 在腫瘤相關的巨噬細胞上表達，并在TME 中起作用。有研究發現SIGLEC15 由巨噬細胞集落刺激因子（macrophagocyte colony stimulating factor，M-CSF）誘導，并在與腫瘤相關的巨噬細胞上表達［23］。唾液酸Tn+腫瘤細胞系與M-CSF 誘導的人類巨噬細胞或SIGLEC15+骨髓細胞系的共培養可增強髓樣細胞轉化生長因子（TGF）-β 的產生，這取決于DAP12 和SYK 蛋白的表達。這些發現表明，SIGLEC15 可能在TME 中起作用，但尚需進一步行體內實驗進行驗證。

一項研究揭示了SIGLEC15在腫瘤中的作用［24］，他們發現，SIGLEC15 蛋白在體外可抑制T 細胞增殖和活化，這一點已在體內使用SIGLEC15 敲除小鼠進行了驗證。T 細胞抑制依賴于IL-10，但目前IL-10 是由髓樣細胞還是由T 細胞產生的尚未可知。他們還發現，SIGLEC15 在非小細胞肺腫瘤臨床樣本中的腫瘤細胞和/或與腫瘤相關的基質細胞（包括與腫瘤相關的巨噬細胞）上表達，而其與PD-L1 的表達互斥。在小鼠黑素瘤模型中，SIGLEC15 缺乏促進T 細胞反應，因此具有更好的腫瘤控制和總體生存。在野生型小鼠中用單克隆抗體靶向SIGLEC15 可以逆轉T 細胞的抑制作用，從而減弱腫瘤的生長［24］。值得注意的是，盡管SIGLEC15 與免疫調節分子的“B7 家族”沒有特別緊密的相似性，但SIGLEC15 的表達［被干擾素-γ（IFN-γ）抑制］與PD-L1 的表達負相關（后者被誘導）。這表明靶向SIGLEC15治療可能是針對PD-1/PD-L1難以進行靶向治療的腫瘤患者的希望。

近年來，腫瘤免疫學在概念上的重要進展是TME 中存在適應性耐藥機制，以防止執行腫瘤免疫。例如，B7-H1（CD274，PD-L1）可選擇性地在TME 中被誘導，主要是由腫瘤浸潤性T 淋巴細胞中的IFN-γ 引起，這又引發了一系列事件，包括PD-1 與T 細胞的結合，細胞凋亡的傳遞和衰竭信號，這最終導致T細胞的功能障礙［25］。在TME中，SIGLEC15（在腫瘤細胞或基質細胞上）與其在T 細胞上的“受體”之間的相互作用是否需要唾液酸是一個懸而未決的問題。在這方面，有關巨噬細胞通過CD24和SIGLEC-10之間的相互作用（分別針對腫瘤細胞和與腫瘤相關的巨噬細胞）抑制腫瘤細胞吞噬作用的最新報道可能提供了理論基礎。這項研究表明，CD24-SIGLEC-10 相互作用顯然不需要唾液酸，而從腫瘤細胞中除去唾液酸也可增強巨噬細胞的吞噬能力，而與CD24無關［26］。因此，通過蛋白質-蛋白質相互作用實現不依賴聚糖的SIGLECS功能是可能的。

2 SIGLEC15配體

Takahata 等［27］的研究小組在發現SIGLEC15 之前就證明了唾液酸參與破骨細胞的分化。Chang 等［28］開發了一種使用酪酰胺自由基化原理將生物素標記引入SIGLECS的蛋白配體中的方法。簡而言之，將表達SIGLEC15配體的細胞與過氧化物酶偶聯的重組SIGLEC15探針孵育，該探針會生成短壽命的生物素-酪酰胺自由基，該自由基與附近的酪氨酸殘基反應以產生穩定的加合物。使用這種方法，研究確定CD44（一種高度糖基化的蛋白質）是RAW264.7 細胞上SIGLEC15 的配體。在RAW264.7 細胞中敲除CD44 減少SIGLEC15 結合并減弱細胞融合。這一發現還表明CD44 可能是SIGLEC15 的腫瘤細胞相關配體，因為CD44 在許多類型的實體瘤中高度表達［29］。但是，在TME 中，CD44 是否作為SIGLEC15 的T 細胞配體（或更確切地說是“受體”）從而起作用尚未可知，所以需要進一步深入的研究來探討其作用。

如上所述，盡管唾液酸基Tn 是SIGLEC15 的優選配體，但該研究中使用的聚糖探針受到限制。據報道，類似這些寡糖的唾液酸化和硫酸化的寡糖配體（Neu5Acα 2-3-3［HSO3-6］Galβ1-4GlcNAcβ1）是SIGLEC15 的優選配體，并且這種結構可能存在于軟骨中的硫酸角質素上［30］。測試該唾液酸化的和硫酸化的聚糖結構是否被SIGLEC15 識別具有重要意義。然而，目前仍未完全理解SIGLEC15所優先識別的生物學相關聚糖的確切結構。

Macauley 和Wu 也用一種名為“基于細胞的聚糖陣列”的新方法來尋找SIGLEC15 優先識別的聚糖。他們通過唾液酸轉移酶（ST6Gal-1 或ST3Gal-Ⅳ）將具有炔基的唾液酸衍生物（即被N-炔丙氧基羰基取代的C5-）引入唾液酸缺陷型細胞系的細胞表面糖綴合物中［31］。通過點擊化學，唾液酸結構通過帶有疊氮化物基團的小型化學化合物的庫而多樣化。他們發現一些唾液酸衍生物是SIGLEC15 的配體。這些研究在一起證明了化學生物學如何指導SIGLEC15 的特異性和高親和力抑制劑的發現。進一步研究以鑒定SIGLEC15 優先識別的聚糖結構，以及此類聚糖的結構多樣化，再結合結構-活性關系分析，最終可能會產生具有翻譯潛力的有效SIGLEC15抑制劑。

3 總 結

研究表明，SIGLEC15在TME中具有生物學作用。盡管尚不清楚SIGLEC15調節抗腫瘤免疫的確切機制，但已發表的數據表明SIGLEC15 可能與T 細胞上的某些蛋白質“受體”結合并抑制T 細胞反應。未來的研究顯示使用化學生物學工具揭示SIGLEC15 的T 細胞上的相互作用伴侶，將進一步增進我們對SIGLEC15的作用原理的了解，并且增加通過利用這些知識從而取得治療獲益。