蘋果青棗酵素發酵過程中生物學特性和抗氧化活性研究

宋愛偉，畢 紅，陳亞軍，吳林生，徐德聰，王 偉

(合肥師范學院 生命科學學院，安徽 合肥 230601)

1 研究背景

蘋果作為人們最經常食用的水果之一，從其個頭的大小、鮮艷程度、表面光滑度和氣味香度等方面區分，可分為三大類：一類是尾食品種；一類是酒用品種；一類是烹調品種[1]。不同品種的蘋果，丹寧、酸度與糖分的含量各不相同[2]。此外，蘋果還具有降低膽固醇、保護肺部不受煙塵的影響、緩解不良情緒和提神醒腦等功能。蘋果中含有人體所需的大多數微量元素，飯前吃蘋果可以使人食欲降低，從而減少進食量，達到減肥的目的。這些特性，使得蘋果深受大眾的喜愛。

青棗學名牛奶棗，是一種常見的熱帶水果。其中含有豐富的營養物質，有清涼解毒的功效。[3]此外，其還具有抗氧化、抗癌等功能，可以增強人類的免疫力、促進血液循環，常常吃青棗，不但可以美容養顏，而且還能夠延緩衰老。

蘋果和青棗通常作為鮮食或用來打漿收汁，但收汁剩下的蘋果泥和青棗泥往往當垃圾丟棄，這樣不但浪費資源而且污染環境。蘋果泥和青棗泥糖類含量非常高，兩者所含的大量營養成分為微生物的生長提供了良好的環境。因此，將蘋果泥和青棗泥經微生物發酵制成酵素，可以減少資源浪費，為農產品深加工和帶動產業扶貧提供新的思路。

由于蘋果和青棗都是常見的可食用水果，研究主要探究用這些可食用水果做成可食用植物酵素[4]。可食用植物酵素的營養物質含量非常多，含有微生物發酵中產生的一些次級代謝產物及其活性成分，而其本身就含有多種酶、維生素和礦物質元素等[5]。相比于直接食用青棗和蘋果，可食用酵素中的營養物質更加容易被人體吸收利用。

以新鮮蘋果泥和青棗泥作為原材料，研究在發酵過程中各種生物學特征的改變以及酵素液中的抗氧化活性變動規律。以期為可食用蘋果青棗酵素作用和功能的進一步闡釋、分析提供理論基礎。蘋果青棗酵素所呈現出的良好生理活性與其發酵過程有著緊密的聯系，但目前蘋果青棗混合發酵的酵素類型卻鮮有報道。因此，深入地探究蘋果青棗酵素在發酵環境中的各種生物學特征和其抗氧化活性的改變，對研究和開發高品質的蘋果青棗酵素產品具有重要作用。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

實驗所使用的實驗材料見表1。

表1 生物學特性和抗氧化活性研究實驗材料

2.2 實驗儀器

實驗所用儀器見表2。

表2 生物學特性和抗氧化活性研究實驗儀器

2.3 實驗方法

2.3.1 蘋果青棗酵素的制備

將蘋果泥和青棗泥與水1:2混勻后，加入不同含量的木聚糖酶(0U/g，150U/g，300U/g，450U/g，600U/g)，首先55℃酶解5h，再加入2%蔗糖、0.05%磷酸氫二鉀、0.2%酵母膏、0.1%氯化鋅、0.1%硫酸鎂、0.05%磷酸二氫鉀。滅菌、冷卻后，接種0.25%酵母菌，于30℃發酵24h，接種0.1%乳酸菌，37℃下發酵24h，最后于2～8℃下發酵24h，使基質產香[6]。

2.3.2 生物量的測定

取適量發酵液，離心沉淀后即為生物[7]。

2.3.3 pH值的測定

按照pH計說明書指導測定[8]。

2.3.4 可滴定酸度的測定

吸得1mL發酵液測量其重量，記為(W)，后定容至100mL的蒸餾水中，則稀釋倍數為100，記為(F)，加入酚酞指示劑4滴，用0.1%mol/L NaOH(C)溶液滴定至微紅色30s內不褪色，記錄消耗NaOH的體積(V)，平行測定三次。可滴定總酸度的計算公式：

總酸度(%)=V·C·K·F×1000/W

K為酸的換算系數[9]。

2.3.5 還原糖含量的測定

參照DNS法[10]。

2.3.6 總黃酮含量的測定

稱取20mg蘆丁標準品于200mL的容量瓶中，加入70%乙醇溶液溶解并定容，得到0.1mg/mL的蘆丁標準溶液。分別吸取0.00mL，0.30mL，0.60mL，1.20mL，1.80mL，2.40mL，3.00mL標準液于5mL的容量瓶中，加入0.4mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6min后加入0.4mL 10%的硝酸鋁溶液，靜置6min，然后加入1.2mL 4%的氫氧化鈉溶液，用70%的乙醇溶液定容，搖勻，靜置15min后于510nm處測定吸光度，同時設置空白對照。發酵液經離心后收集上清液，按照上述方法測得510nm處吸光度，通過標準曲線計算發酵液中黃酮含量(mg/mL)[11]。

2.3.7 還原力的測定

參照鐵氰化鉀法[12]，吸光度的高低與還原力強弱成正比。

2.3.8 羥自由基清除力的測定

參照鄰二氮菲法[13]。

2.3.9 超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定

參照鄰苯三酚自氧化法[14]。

3 實驗結果與分析

3.1 發酵過程中生物量的變化

由圖1可知，在蘋果和青棗酵素發酵過程中，生物量呈現不斷上升的趨勢。其中，30～42h生物量快速上升，可能是由于乳酸菌快速增殖，產生了大量的代謝產物，導致生物量快速上升；但當到達42h后，生物量幾乎不再增加，可能是由于發酵時間過長，濕菌體繁殖受到抑制。同時，在發酵前期加入的木聚糖酶的含量對于溶液的生物量也有影響，同等發酵時間下，木聚糖酶的含量越高生物量越多，當木聚糖酶的含量為600U/g時，生物量最高。

圖1 發酵過程中生物量的變化

3.2 發酵過程中pH值的變化

由圖2可知，由于酵母菌是需氧型真菌，在發酵前期，采用通氣發酵會使發酵液的pH值降低，這可能是由于酵母菌代謝生成的有機物質造成的；24h之后接入乳酸菌，因為乳酸菌是厭氧型細菌，所以對發酵液進行靜置封閉發酵。結果顯示：發酵液的pH值降低的速度會加快，大量增加的乳酸菌會不斷將糖類等物質轉化成乳酸，從而導致發酵液酸度上升。同時，在發酵前期加入木聚糖酶的含量對于發酵液的pH值也有一定的影響，木聚糖酶的含量越低，溶液的酸度越弱，pH值越大，其中不加入木聚糖酶時的發酵液的pH值最大，48h后pH值為4.31。

圖2 發酵過程中pH值的變化

3.3 發酵過程中可滴定酸度的變化

由圖3可知，隨著發酵的不斷進行，可滴定酸度總體呈現出不斷上升的趨勢，在0～24h時，酵母菌產生二氧化碳、有機酸等物質，導致發酵液的酸度不斷上升；24h后又加入的乳酸菌將碳水化合物轉化為乳酸，也導致了發酵液的酸度不斷上升。在發酵前期加入木聚糖酶的含量對于發酵液的酸度也有影響，木聚糖酶的含量越高，溶液的酸度越強，則可滴定酸度越高，其中可滴定酸度最高的為加入600U/g木聚糖酶的發酵液，達0.65%。

圖3 發酵過程中可滴定酸度的變化

3.4 發酵過程中還原糖含量的變化

如圖4所示，實驗得到的葡萄糖標準溶液標準曲線方程為y=0.5788x-0.0148，R2=0.9985。由圖5可知，還原糖含量在6h內呈現上升趨勢，可能是因為在發酵過程中酵母菌充分發動蔗糖酶水解蔗糖誘使蔗糖不斷水解為葡萄糖和果糖，使得還原糖含量呈現上升的趨勢，在發酵6～24h期間還原糖含量呈現不斷下降的現象能說明這個階段酵母菌增殖量較大。加入乳酸菌之后，在6h內還原糖含量下降速度較明顯，表明這個階段乳酸菌繁殖量也比較大。同時，在發酵前期加入木聚糖酶的含量對于溶液的還原糖含量也有影響，木聚糖酶的含量越高，還原糖的含量越高，發酵后期，木聚糖酶的加入量對于還原糖含量影響不大，還原糖的最低含量趨近于0.174mg/mL。

圖4 葡萄糖標準曲線圖

圖5 發酵過程中還原糖含量的變化

3.5 發酵過程中黃酮含量的變化

如圖6所示，實驗所得的黃酮標準溶液標準曲線方程為y=0.0019x-0.019,R2=0.9948。由圖7可知，發酵過程中黃酮含量總體呈不斷上升的趨勢，尤其是在接種乳酸菌后，黃酮含量上升明顯變快，表明這個階段乳酸菌繁殖量也比較大。在發酵過程中乳酸菌可能會破壞植物的細胞壁，而黃酮類物質大部分會與細胞壁中的木質素結合在一起，當細胞壁遭到破壞時，發酵液中的黃酮含量則會上升。同時，在發酵中加入木聚糖酶的含量對于溶液的黃酮含量也有一定的影響，木聚糖酶含量越高，黃酮含量越高，最后都趨近于359mg/mL，但未加木聚糖酶的含量明顯偏低，趨近于315mg/mL，可能是木聚糖酶在發酵過程中，破壞了蘋果和青棗的細胞壁，使得黃酮的含量有所增加。

圖6 黃酮標準曲線圖

圖7 發酵液過程中黃酮含量的變化

3.6 發酵過程中還原力的變化

由圖8可知，隨著發酵時間的延長，發酵液中還原力總體呈上升趨勢，可能是由于酵母菌和乳酸菌本來就有一定的抗氧化性，也可能是菌體表面和代謝產物中存在一定量的抗氧化物質。酵母菌和乳酸菌的發酵會很大程度的提高蘋果青棗酵素的抗氧化活力。同時，在發酵前期加入木聚糖酶的含量對于溶液的還原力也有一定的影響，隨著木聚糖酶含量的增高，發酵液的抗氧化性會增強，故還原力會不斷升高。其中不加木聚糖酶的發酵液還原力最低，在48hOD值達到0.208，加入600U/g木聚糖酶的還原力最高，在48hOD值達0.268。

圖8 發酵液過程中還原力的變化

3.7 發酵過程中羥自由基清除率的變化

由圖9可知，隨著發酵時間的推移，發酵液內羥自由基的清除率逐漸呈現不斷增加的趨勢，這很有可能是因為酵母菌和乳酸菌自身都具有較強的抗氧化作用。此外，發酵過程中酵母菌和乳酸菌可能誘發發酵液對超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、還原型輔酶Ⅰ氧化酶和還原型輔酶Ⅰ過氧化酶等多種抗氧化酶產生清除活性氧的活動[15-17]。說明蘋果青棗酵素經過酵母菌和乳酸菌的發酵，其抗氧化性得到了極大的增強。同時，在發酵前期添加木聚糖酶的含量對于發酵液中的羥自由基清除率也會產生影響，木聚糖酶的含量越高，羥自由基清除率越高，但在發酵達48h后都趨近于99%。

圖9 發酵液中羥自由基清除率的變化

3.8 發酵過程中SOD酶活力的變化

由圖10可知，發酵液中SOD酶活力會隨著發酵的時間增加而增強。對照圖1中生物量的結果來看，可以很明顯地看出兩個圖具有相關性。這些現象表明了乳酸菌和酵母菌兩種菌類都可以產生超氧化物歧化酶使蘋果青棗酵素的抗氧化活性得到提高。同時，在發酵前期加入木聚糖酶的含量對于發酵液的SOD酶活力也有一定的影響，木聚糖酶的含量越高，SOD酶活力也越強，當加入的木聚糖酶含量為600U/g時，SOD酶活力達到111U/mL。

圖10 發酵液中SOD酶活力的變化

4 實驗結論

本文以新鮮的蘋果泥和青棗泥作為原材料，在基質中加入了兩種常用菌種發酵(乳酸菌和酵母菌)，研究了在發酵過程中的各種生物學特性和抗氧化活性的變動規律。在發酵過程中，通過測量可以得出：(1)生物量不斷上升，當到達42h后，生物量幾乎不再增加，當木聚糖酶的含量為600U/g時，生物量最高為1.09g。(2)pH值呈現下降趨勢，不加入木聚糖酶時的發酵液的pH值最大，48h后pH值達4.31。(3)可滴定酸度總體呈現出不斷上升的趨勢，可滴定酸度最高的為加入600U/g木聚糖酶的發酵液，達0.65%。(4)還原糖含量在6h內呈現上升趨勢，在發酵6～24h期間還原糖含量不斷下降，說明這個階段酵母菌增殖量較大；加入乳酸菌之后，在6h內還原糖含量下降速度較明顯，表明這個階段乳酸菌繁殖量也比較大；木聚糖酶的含量越高，還原糖的含量越高，發酵后期，木聚糖酶的加入量對于還原糖含量影響不大，還原糖的含量趨近于0.174mg/mL。(5)黃酮含量呈不斷上升的趨勢，木聚糖酶含量越高，黃酮的含量越高，最后都趨近于359mg/mL，但未加木聚糖酶的含量明顯偏低，趨近于315mg/mL。(6)還原力總體呈上升趨勢，在48hOD值達到0.208，加入600U/g木聚糖酶的發酵液還原力最高，在48hOD值達0.268。(7)羥自由基的清除率逐漸呈現不斷增加的趨勢，木聚糖酶的含量越高，羥自由基清除率越高，在發酵48h后清除率趨近于99%。(8)SOD酶活力不斷上升，木聚糖酶的含量越高，SOD酶活力也越強，當加入的木聚糖酶含量為600U/g時，SOD酶活力達到111U/mL。

綜上，經酵母菌和乳酸菌發酵后的蘋果青棗酵素的抗氧化活性大大提高，利用收汁后的蘋果泥和青棗泥，不但避免了浪費，還減少了環境污染，實現了資源的充分利用，為農產品深加工和帶動產業扶貧提供新思路。