多管發酵法測定水體中糞大腸菌群的方法驗證及質量控制

鄧澤 魯朝旭 袁姁 王馥云 余世東

摘 要：糞大腸菌群作為指示水體糞便污染的菌群，在環境監測中是很重要的項目。本文通過對空白實驗、陰陽性對照、精密度、準確度等試驗，對新方法進行了實驗室驗證，并對不確定度、注意事項和優缺點等方面進行了探討，為多管發酵法測糞大腸菌群的準確性提供一定參考和技術保障，希望能夠更好地服務于環境監測工作。

關鍵詞：糞大腸菌群;多管發酵法;不確定度;方法驗證

中圖分類號：X832

糞大腸菌群在微生物項目中是總大腸菌群中的一部分，主要用來表明水質受糞便污染的程度。糞大腸菌群是一類能使乳糖發酵、產酸產氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在44.5℃培養24～48h能發酵乳糖產酸產氣。水體糞大腸菌群含量的高低與周邊經濟發展、企業影響、人口等因素密切相關，水體超標會影響整個流域生態環境，對人體健康極為不利。通過對糞大腸菌群的監測，可了解水體受生活污水污染的狀況。目前，WHO、ISO以及世界上絕大多數國家都以糞大腸菌作為水質糞便污染指標菌。糞大腸菌群適用于河流、湖泊等地表水、企業污水及醫院廢水的監測，是綜合評價城鎮污水尤其是生活污水污染的一個必不可少的重要指標[1-3]。

國際上測糞大腸菌群的實驗方法主要有，多管發酵法、酶底物法、紙片法、濾膜法等，近幾年來，我國在糞大腸菌群的監測方面取得了很大進步，糞大腸菌群的相關環境標準也在不斷的更新。我國剛剛也出臺和變更了多管發酵法的新標準，酶底物法、多管發酵法等[1-2]。我國多用多管發酵法進行檢測。

1 方法

1.1 監測方法[2]

根據水樣的污染程度，選擇樣品的接種量。將樣品加入在含乳糖蛋白胨培養基的試管中（根據樣品濃度采取不同的培養試管或者三角燒瓶），在37±0.5℃培養箱里進行初發酵實驗，培養24小時。對于產酸產氣的試管進行復發酵驗證實驗，輕微振蕩試管，用接種環接種到裝有EC培養基的試管中，在44.5±0.5℃下進行復發酵培養24小時，最后得出產氣的細菌為糞大腸菌群。

1.2 執行標準[3]

1.3 儀器和設備

（1）恒溫培養箱：37±0.5℃、44.5℃±0.5℃。

（2）高壓蒸汽滅菌器：121℃、101.3kPa。

（3）采樣瓶：500mL、250mL。

（4）移液管：1±0.01mL、10±0.1mL。

（5）試管：20mL、10mL

（6）接種環：直徑3mm。

1.4 試劑

EC培養基、單倍乳糖蛋白胨培養基、3倍乳糖蛋白胨培養基。

2 采樣

通過對南充市順慶區3條河流進行采樣。用水樣采集器采集表層水，每件樣品量為500mL，裝入已經滅菌處理的采樣瓶中，采集6個平行樣，并4℃以下冷藏保存。采樣瓶需用牛皮紙包扎滅菌[4]。

3 分析與討論

3.1 空白實驗

每次試驗均用無菌生理鹽水按照步驟進行空白測定，培養后無任何顏色變化，測定結果均符合實驗要求。

3.2 陰陽性對照

將糞大腸菌群的標準菌株制成一定濃度的菌懸液，分別取相應水量的菌懸液按接種的要求接種于試管中，然后按實驗要求培養，陽性菌株（大腸埃希氏菌）呈陽性反應，陰性菌株（產氣腸桿菌）呈陰性反應，該測定結果符合實驗要求。

3.3 精密度檢驗

對三種濃度的水樣進行了6次重復測定，并計算其相對偏差、相對標準偏差，檢驗該方法的精密度。從測定的結果得出，樣品1的測定均值為34.50MPN/L，樣品1取對數為154MPN/L，相對標準偏差為2.47%;樣品2的測定均值為7616.67MPN/L，樣品2取對數為3.88MPN/L，相對標準偏差為5.22%;樣品3的測定均值為12666.67MPN/L，樣品3取對數為4.1MPN/L，相對標準偏差為0.93%。以上樣品的精密度結果均符合驗證要求具體測定結果見表2。

3.4 準確度分析

根據多管發酵法有證標準物質/標準樣品測試數據，有證標準物質所測標樣平均值為23MPN100m/L，有證標準物質真值為21±7MPN/100mL，可接受范圍為6-121MPN/100mL，相對誤差REi為1.0%。根據《水質糞大腸菌群的測定多管發酵法》（HJ347.2-2018）方法要求，準確度實驗驗證符合方法要求。

綜上所述，采用多管發酵法檢測水中的糞大腸菌群，對樣品進行空白對照、陰陽性對照、以及對精密度和準確度進行驗證，結果都在質控范圍內。實驗室按照以上要求可獲得準確的數據，滿足其方法要求。

4 不確定度分析

影響糞大腸菌群MPN值計算結果不確定度的因素有很多，例如：培養基稱量配制過程的誤差、取樣稀釋過程引起的誤差、樣品保存條件、購買培養基質量的好壞、培養時間長短、培養溫度的控制等[5-7]。

5 注意事項

（1）樣品采集時，可加入適量硫代硫酸鈉消除活性氯的干擾;如果確定水樣重金屬離子含量高的，可加入乙二胺四乙酸二鈉溶液消除干擾;采集樣品時，堅持細菌樣優先原則，盡可能直接采樣，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。

（2）樣品保存時，需要在10℃以下冷藏，6h內完成測定。建議在采集細菌樣時，車上安裝車載冰箱或者其他冷藏設備，實時監測樣品溫度。

（3）樣品測試時，在樣品濃度比較低，易出現陽性結果不明顯的發酵管，實驗員應將所有有可能的試管都進行復發酵;初發酵24小時后未發現產氣，可以適當地延長培養時間[6];培養基分裝滅菌時，排盡發酵管內倒管中的氣泡，否則會出現假陽性結果;吸取不同濃度的稀釋液時，必須規范操作，及時更換移液管。

（4）定期使用有證標準樣品進行質量控制，使用有證標準菌株進行陰陽性對照試驗，用無菌水做全程序空白和實驗室空白測定。

（5）培養箱溫度的均勻性和穩定性對多管發酵法的影響比較大，有條件最好放置精確的自動記錄溫度儀實時監控培養箱溫度[8]。

6 優缺點

目前出臺的糞大腸菌群的標準很多，各有優缺點。多管發酵法有著原理簡單、技術難度容易、實驗準確度高、價格便宜、利于推廣的優點，但操作步驟比較煩瑣、需要確認實驗、實驗周期相對比較長，檢測時間需要48～72小時，消耗大量人力、物力，不適于大批量樣品的分析[9]。

參考文獻：

[1]國家環境保護總局水和廢水監測分析方法編委會.水和廢水監測分析方法[M].第四版.北京：中國環境科學出版社，2003.

[2]國家生態環境部.水質糞大腸菌群的測定多管發酵法（HJ347.2-2018）[S].北京：中國標準出版社，2018.

[3]國家環境保護總局.地表水環境質量標準（GB3838-2002）[M].中華人民共和國環境保護標準GB3838-2002.

[4]陳巧，李晉，李曉曼，袁姁.地表水采樣的質量控制措施探討[J].科技創新與應用，2020，（25）：119-123.

[5]何敏，張亞娟，周艷紅，等.水中糞大腸菌群檢測方法的對比[J].凈水技術，2018（09）：27-30.

[6]魯朝旭，袁姁，陳巧，李曉曼，梁時軍.糞大腸菌群監測分析中存在的問題探討[J].綠色科技，2019，（14）：178-181.

[7]張貴剛，黃博珠.糞大腸菌群多管發酵法不確定度的評定[J].資源節約與環保，2018（8）：37，48.

[8]黎堯，張紹斌.多管發酵法測定水質糞大腸菌群的探討[J].環境與發展，2019（5）：116.

[9]趙長征.淺談水中糞大腸菌群檢測方法及其研究進展[J].華東科技（綜合），2019（8）：0479-0480.

作者簡介：鄧澤（1988— ），男，漢族，四川南充人，助理工程師，主要從事環境監測分析與評價工作。

*通訊作者：袁姁（1995— ），女，漢族，重慶開州人，助理工程師，主要從事環境監測分析與評價工作。