黃芪甲苷對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷NLRP3 炎性小體表達的影響

李娜 穆亞平 劉春英 王陽 李曉鋒 王雪薇

（1.遼寧中醫藥大學中西醫結合學院，遼寧沈陽 110847；2.沈陽市兒童醫院神經康復實驗室，遼寧沈陽 110032）

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是由圍生期窒息引起的腦缺氧缺血性損害，是新生兒死亡和傷殘的主要原因。除亞低溫治療外，諸如硫酸鎂、促紅細胞生成素、間充質干細胞移植等治療方法尚未在臨床廣泛應用,而且存在爭議[1-2]。在接受亞低溫治療的中、重度HIE 嬰兒中，仍有近31.6%～51.4%的患者殘障存活[3-5]。因此，有必要尋找新的安全有效的治療方法來促進HIE 患兒神經系統康復。缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）是HIE 的病理過程，缺氧缺血再灌注時中性粒細胞聚集、炎癥介質釋放增多，因此深入研究各種黏附因子和炎癥介質的作用機制，及早發現拮抗措施，可能是預防和減輕HIBD 的途徑之一。Nod樣受體蛋白3（NLRP3）是一種多蛋白復合體，能夠識別病原體相關模式分子和危險因素相關模式分子等信號，激活半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1），活化的Caspase-1 能夠剪切打孔Gasdermin D 蛋白（GSDMD），導致炎癥因子白細胞介素（IL）-1β和IL-18 釋放，從而誘導細胞焦亡[6]。NLRP3 和Caspase-1 與多種神經系統疾病有關，如缺血性中風、動脈粥樣硬化斑塊形成、阿爾茨海默病、帕金森病等[7-8]。Serdar 等[9]發現，HIBD 24 h 后，小膠質細胞活化和神經元損傷與NLRP3 炎性小體基因的表達上調有關。Ystgaard 等[10]的研究則提示新生小鼠腦缺氧缺血后24 h，NLRP3 在海馬中表達上調2.6 倍，高于紋狀體和丘腦，NLRP3 炎性小體信號通路激活與神經細胞死亡相關且不利于機體自身早期保護機制的啟動。

黃芪甲苷（astragaloside IV, AS-IV）是黃芪的主要活性成分之一，是黃芪皂苷類的單體成分，可通過抑制炎癥反應發揮神經保護作用[11]。研究顯示，AS-IV 具有抗抑郁作用，其抗抑郁的作用是通過上調過氧化物酶體增殖物激活受體γ 的表達來抑制小鼠海馬區NF-κB 磷酸化、降低NLRP3 炎癥小體和IL-1β 的表達發揮作用[12]。Li 等[13]研究發現AS-IV 通過抑制NLRP3 信號通路，減輕腦缺血再灌注誘導的小鼠短暫性認知障礙。AS-IV 是一種潛在的神經保護劑，但其在新生兒HIBD 中的作用機制有待進一步研究。新生兒大腦在發生HIBD后其適應和再生能力有限，而海馬齒狀回的腦室下帶和顆粒下層是神經發生的主要部位，因此關于中樞神經系統的信號通路的研究常集中在海馬體結構上[14-15]。本實驗通過建立乳鼠HIBD 模型及小鼠海馬神經元HT22 細胞缺氧模型，觀察AS-IV對NLRP3 炎性小體的干預作用，并初步探討其治療最佳干預濃度，旨在為臨床治療新生兒HIE 提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 動物及細胞

Sprague-Dawley 雄 性2 日 齡 仔 鼠30 只 由 遼寧省長生生物技術股份有限公司提供[動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001]。小鼠海馬神經元HT22 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號CL-0595）。

1.2 主要試劑及耗材

AS-IV（含量＞98%，20 mg）購自大連美侖生物技術有限公司（貨號J0201AS），分子量為784.97 g/mol。DMEM 高糖培養基（SH30022.01，HyClone 公 司， 美 國 ），DMEM 無 糖 培 養 基（90113）、DMSO（D8371）購自北京索萊寶科技有限公司，yo-PRO-1（V23201）、EthD-2（E3599）購自美國Thermofisher 公司，β-actin（66009-1-Ig，Proteintech 公司，美國）；磷酸鹽緩沖液、胰酶、青鏈霉素、二抗均購自美國Gibco 公司；NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD、CCK-8 一抗均購自英國Abcam 公司。

1.3 分組及模型建立

仔鼠養育至第7 日，SPF 級條件飼養。選擇體重10～14 g 的7 日齡新生大鼠24 只，隨機分為假手術組、HIBD 組和AS-IV 治療組（AS-IV 組），每組均8 只。HIBD 組參照文獻[16]造模：仔鼠用異氟醚麻醉后行右側頸總動脈雙重結扎。術后放置2 h，待仔鼠完全清醒后再置于37℃恒溫密閉缺氧艙中，以 5 L/min 的流速向艙內輸入8%O2+92%N2的混合氣體，持續60 min 后取出；假手術組僅用眼科器械切開皮膚，鈍性分離右側頸總動脈，不予結扎，直接進行皮膚縫合。AS-IV 組在造模后，立即將AS-IV（10 mg/kg）溶于DMSO 液中（10 mL/kg），根據仔鼠體重進行計算后灌胃，每8 h 1 次，共記3 次。結束后將仔鼠放回母鼠籠中飼養，24 h 后異氟醚麻醉，行腦部組織取樣。

1.4 腦組織蘇木精-伊紅染色

取造模后24 h 仔鼠，3%～4%異氟醚麻醉處死，取腦組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，分級酒精脫水，石蠟包埋。腦組織石蠟塊沿冠狀面行5 μm厚度切片，然后行蘇木精-伊紅（HE）染色，萊卡DM4B 光學顯微鏡觀察各組大鼠腦組織海馬的病理變化。

1.5 AS-IV 對仔鼠腦組織細胞焦亡的影響

采用yo-PRO-1 和EthD-2 染色劑檢測細胞焦亡[17-18]。取造模后24 h 仔鼠腦組織，用4%多聚甲醛固定腦組織48 h，冷凍切片法制作切片，腦組織切片厚度為5～10 μm。將腦組織切片置于載玻片上，暗室環境中PBS 液洗4 次，每次5 min；分別加入yo-PRO-1 和EthD-2 抗體（工作濃度均為1 : 1 000），室溫孵育30 min，PBS 液洗4 次，每次5 min；最后加入DAPI 復染細胞核，暗室室溫孵育20 min 后用抗熒光淬滅封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察細胞焦亡的變化。

1.6 細胞缺氧模型構建與給藥

小鼠海馬神經元HT22 細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，隔天換液。隨機分為對照組、氧糖剝奪（OGD）組、OGD+AS-IV 組。對照組為常規培養（37℃、5%CO2）的HT22 細胞；海馬神經元細胞OGD 模型建立[19]：棄去正常培養基，PBS 液清洗2 次，加無糖無血清DMEM 培養基，將細胞置于充滿95%N2和5%CO2的厭氧袋中孵育2 h，2 h后取出細胞，棄去無糖無血清DMEM 培養基，換為正常培養基在37℃、5%CO2細胞培養箱中繼續培養。

OGD+AS-IV 組 每 孔 加 入100 μL 2 000 個 細胞，按24 h 孵育時間標準，設置AS-IV 濃度梯度（50～400 μmol/L）來明確藥物的最佳濃度。

AS-IV 配 制 方 法： 將AS-IV 溶 于2.548 mL DMSO 液中，先稀釋成10 mmol/L 的儲存溶液，然后用培養液稀釋，使藥物終濃度分別為50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L，每 個 濃 度重復6 個復孔。

1.7 CCK-8 法檢測細胞活力

將HT22 細胞接種于96 孔板，分別在常規培養條件和缺氧條件下培養24 h，再加入不同濃度AS-IV，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育1 h，在450 nm 波長測定吸光度，檢測缺氧條件下不同AS-IV 濃度對HT22 細胞活力的影響。實驗獨立重復3 次。

1.8 Western blot 檢測相關蛋白的表達

處理后的各組細胞加入RIPA 細胞裂解液，在預制電泳膠中按照每孔10 μL 加入蛋白樣品及marker，空白孔中補充10 μL 蛋白上樣緩沖液，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉移至PVDF 膜，TBST 緩沖液洗膜，3%脫脂奶粉封閉3 h，分別加入一抗NLRP3、Caspase-1、GSDMD（均為1 : 1 000稀釋）、IL-1β（0.1 μg/mL），以β-actin（1 : 10 000稀釋）為內參，4℃孵育過夜，洗膜后分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗大鼠IgG（1 : 3 000）和山羊抗兔IgG（1 : 10 000）二抗孵育1 h，ECL 化學發光顯色。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值之比計算目的蛋白的相對表達量。實驗獨立重復3 次。

取仔鼠腦組織損傷側海馬組織進行勻漿并加入裂解液，Western blot 法檢測AS-IV 對HIBD 新生大鼠海馬組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白的影響，操作步驟同細胞實驗。

1.9 RT-qPCR 法 檢 測 細 胞 內GSDMD、NLRP3、IL-1β、Caspase-1 的mRNA 水平

收集各組細胞后使用TRIzol 法提取各組細胞總RNA，并測定濃度。使用One Step TB Green?PrimeScript?RT-PCR Kit試劑盒（日本TaKaRa公司）進行檢測。PCR 反應體系（20 μL）：2×Buffer 10 μL，Ex Taq HS 0.4 μL，enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ0.4 μL，Total RNA 2 μL，RNase Free dH2O 6 μL。PCR 反應條件：95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40 個循環。結果采用2-ΔΔCT法計算mRNA 的相對表達量。引物序列由沈陽實創生物技術有限公司合成（表1）。實驗獨立重復3 次。

表1 RT-PCR 引物序列

1.10 統計學分析

采用 SPSS 24.0 統計軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AS-IV 對HIBD 新生大鼠的影響

造模24 h 后腦組織HE 染色顯示，與假手術組比較，HIBD 組海馬區錐體細胞層細胞密度降低、排列松散、層次紊亂，部分細胞可見空泡樣變性和典型急性缺血性紅色神經元；AS-IV 組海馬神經元細胞變性程度減輕，急性缺血性改變明顯減少（圖1）。

采用yo-PRO-1 和EthD-2 染色劑檢測細胞焦亡，HIBD 組焦亡細胞（核內綠/藍雙陽性，青色為主）明顯增多，同時可見少量壞死細胞（陽性細胞核內呈紅色）；AS-IV 組則顯示焦亡細胞和壞死細胞均明顯減少。見圖2。

2.2 AS-IV 對乳鼠焦亡相關蛋白NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 表達水平的影響

與假手術組比較，HIBD 組腦組織NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 表 達 水 平 明 顯 升 高（P＜0.05）；AS-IV 組 腦 組 織NLRP3、Caspase-1及GSDMD 表達水平顯著低于HIBD 組（P＜0.05），且與假手術組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；AS-IV 組腦組織IL-1β 表達水平與HIBD 組比較差異無統計學意義（P＞0.05），且仍高于假手術組（P＜0.05）。見表2 和圖3。

2.3 不同濃度AS-IV 對缺氧處理后HT22 細胞活力的影響

CCK-8 實驗結果顯示，HT22 細胞OGD 模型建立后，細胞活力較對照組明顯下降（P＜0.05）；與OGD 組比較，缺氧處理后的HT22 細胞應用100～400 μmol/L AS-IV 干預后，HT22 細胞活力均升高（P＜0.05）；AS-IV 藥物濃度在200 μmol/L 時能明顯減輕缺氧損害，與OGD 組比較，細胞活力升高最明顯。見表3。

圖1 AS-IV 對HIBD 新生大鼠腦組織的影響（蘇木精-伊紅染色，×200） 與假手術組比較，HIBD 組細胞排列層次紊亂，可見典型急性缺血性紅色神經元及細胞空泡樣改變；AS-IV 治療后，急性缺血性紅色神經元明顯減少，細胞空泡樣變性程度降低。白色箭頭示缺血性神經元，表現為細胞核固縮，紅染；黑色箭頭示細胞空泡樣改變。

圖2 AS-IV 對HIBD 新生大鼠細胞焦亡的影響（免疫熒光，×100） 與假手術組比較，HIBD 組焦亡細胞（核內綠/藍雙陽性，青色為主）明顯增多，同時可見少量壞死細胞（陽性細胞核內呈紅色）。白色箭頭示焦亡細胞，紅色箭頭示壞死細胞。

表2 各組腦組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白檢測結果比較 （n=8）

表2 各組腦組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白檢測結果比較 （n=8）

注：[NLRP3] Nod 樣受體蛋白3；[IL-1β]白細胞介素-1β；[Caspase-1]半胱氨酸蛋白酶-1；[GSDMD] Gasdermin D 蛋白。a 示與假手術組比較，P＜0.05；b 示與HIBD 組比較，P＜0.05。

組別 NLRP3 IL-1β Caspase-1 GSDMD假手術組 0.084±0.029 0.107±0.029 0.225±0.099 0.144±0.031 HIBD 組 0.187±0.017a 0.259±0.030a 0.315±0.029a 0.189±0.027a AS-IV 組 0.064±0.029b 0.254±0.030a 0.188±0.017b 0.141±0.030b F 值 23.339 42.939 23.341 4.415 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.037

圖3 Western blot 法檢測各組新生大鼠海馬組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白的表達

2.4 不同濃度AS-IV 對細胞焦亡相關蛋白表達的影響

Western blot 檢測結果顯示，與對照組比較，OGD 組 NLRP3、IL-1β、Caspase-1 和GSDMD 蛋白表達水平均上升（P＜0.05）；與OGD 組比較，應 用50～400 μmol/L 4 個 濃 度AS-IV 干 預OGD 細胞 后，NLRP3、IL-1β、Caspase-1 和GSDMD 蛋 白表達水平均下降（P＜0.05）；NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1 蛋 白 表 達 水 平 在200 μmol/L 和400 μmol/L 兩個濃度組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖4 和表4。

2.5 不 同 濃 度AS-IV 對NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β mRNA 水平的影響

不同濃度AS-IV 干預HT22 缺氧細胞后，應用RT-qPCR 法檢測NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β 的mRNA 水 平。與 對 照 組 比 較，OGD 組NLRP3、IL-1β、Caspase-1 和GSDMD 的mRNA 表達水平均上升（P＜0.05）；與OGD 組比較，應用50～400 μmol/L 4 個濃度AS-IV 干預OGD 細胞后，NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β 的mRNA 表達水平均明顯下降（P＜0.05）；與200 μmol/L 比較，其他濃度AS-IV 干預后NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β mRNA 表 達 水 平 均 有 所 上 升（P＜0.05），提示200 μmol/L AS-IV干預OGD細胞時，上述炎性小體和細胞因子下降最明顯。見表5。

表3 不同濃度AS-IV 對缺氧HT22 細胞活力的影響（，%，n=8）

表3 不同濃度AS-IV 對缺氧HT22 細胞活力的影響（，%，n=8）

注：a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OGD 組比較，P＜0.05。

組別 AS-IV 劑量(μmol/L) 細胞活力對照組 - 74.8±4.1 OGD 組 - 55.6±6.6a OGD+AS-IV 組 50 57.2±5.2a 100 62.1±2.1a,b 200 67.4±1.7a,b 400 64.9±2.3a,b

圖4 Western blot 法檢測不同濃度AS-IV 對各組HT22 細 胞 中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白的影響

表4 各組HT22 細胞NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白檢測結果比較 （，n=3）

表4 各組HT22 細胞NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白檢測結果比較 （，n=3）

注：[NLRP3] Nod 樣受體蛋白3；[GSDMD] Gasdermin D 蛋白；[IL-1β]白細胞介素-1β；[Caspase-1]半胱氨酸蛋白酶-1。a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OGD 組比較，P＜0.05；c 示與50 μmol/L 組比較，P＜0.05；d 示與100 μmol/L 組比較，P＜0.05。

組別 NLRP3 GSDMD IL-1β Caspase-1對照組 0.320±0.021 0.628±0.012 0.472±0.011 0.324±0.062 OGD 組 1.735±0.042a 0.969±0.051a 0.986±0.017a 0.900±0.041a 50 μmol/L 組 1.616±0.095a 0.857±0.063a,b 0.720±0.094a,b 0.716±0.032a,b 100 μmol/L 組 0.531±0.047a,b 0.662±0.037a,b,c 0.653±0.057a,b 0.583±0.042a,b,c 200 μmol/L 組 0.224±0.085a,b,c,d 0.539±0.018b,c,d 0.420±0.049b,c,d 0.275±0.055b,c,d 400 μmol/L 組 0.250±0.056a,b,c,d 0.570±0.027b,c,d 0.450±0.039b,c,d 0.296±0.078b,c,d F 值 27.953 168.171 48.391 80.776 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表5 各組HT22 細胞NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 的mRNA 檢測結果比較 （，n=3）

表5 各組HT22 細胞NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 的mRNA 檢測結果比較 （，n=3）

注：[NLRP3] Nod 樣受體蛋白3；[GSDMD] Gasdermin D 蛋白；[IL-1β]白細胞介素-1β；[Caspase-1]半胱氨酸蛋白酶-1。a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OGD 組比較，P＜0.05；c 示與50 μmol/L 組比較，P＜0.05；d 示與100 μmol/L 組比較，P＜0.05，e 示與200 μmol/L 組比較，P＜0.05。

組別 NLRP3 GSDMD IL-1β Caspase-1對照組 0.426±0.001 0.683±0.013 0.622±0.026 0.681±0.015 OGD 組 1.000±0.021a 1.000±0.022a 1.000±0.032a 1.000±0.035a 50 μmol/L 組 0.658±0.019a,b 0.627±0.005a,b 0.627±0.012a,b 0.629±0.003b 100 μmol/L 組 0.642±0.013a,b 0.689±0.008a,b,e 0.577±0.012b,c 0.643±0.016b 200 μmol/L 組 0.582±0.006b,c,d 0.565±0.008b,c,d 0.446±0.010b,c,d 0.574±0.012b,c,d 400 μmol/L 組 0.651±0.021b,e 0.725±0.058b,c,e 0.717±0.031b,c,d,e 0.702±0.002b,c,d,e F 值 281.247 105.143 278.747 261.974 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

HIE 是導致足月兒死亡和兒童期殘疾的主要原因。隨著現代醫療技術的發展，HIE 的神經保護策略、神經康復技術及相關基礎研究均取得了較大進步，但目前HIE 的治療仍以穩定內環境為目的的支持療法為主，尚無理想的治療方法[20]。AS-IV是黃芪的主要成分，具有抗神經炎癥、抑制細胞凋亡、促進血管神經修復等多重效應。Wang 等[21]系統評估了AS-IV 對實驗性急性缺血性卒中的有效性和可能的機制后認為AS-IV 在腦缺血再灌注損傷過程中可能通過抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用發揮神經保護作用。近年來已有臨床醫生應用黃芪注射液治療HIE、腦性癱瘓等疾病且取得較好的臨床效果[22-23]，但這類治療均處于臨床摸索狀態，其治療HIE 的具體分子機制需要更深入的研究。

神經炎癥是中樞神經系統的一種基本的先天免疫反應，被認為是神經系統疾病的致病因素之一。缺氧缺血引起血管內炎癥級聯反應是新生兒腦損傷病理生理學的重要因素。然而，免疫激活特別是適應性免疫反應對HIBD 的長期影響仍不清楚[24-25]。NLRP3 在實現適應性免疫應答的同時及時關閉固有免疫反應，因此防止炎性小體過度激活對控制炎癥級聯反應尤為重要。抑制NLRP3 炎性小體活性可能成為治療腦外傷、神經退行性疾病等中樞神經系統疾病一種潛在而有效的治療策略[26-27]。唐標等[28]認為AS-IV 可以減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，并抑制NF-κB 磷酸化及NLRP3 炎癥小體活化。

本研究發現，HIBD 組乳鼠腦組織海馬區錐體細胞層細胞密度降低、層次紊亂，部分細胞可見空泡樣變性和典型紅色神經元改變，部分神經元出現急性壞死。細胞焦亡是近年新發現的細胞死亡形式，目前已有學者將焦亡作為治療放射性腦損傷、HIBD 等神經系統疾病的一個潛在治療靶點[29-30]。為了更深入探討HIE 后是否存在焦亡現象，本實驗采用yo-PRO-1 和EthD-2 兩種不同分子量染色劑檢測細胞焦亡。yo-PRO-1 是一種細胞膜封閉的陽離子，可以檢測細胞膜通透性變化[18]；而EthD-2 由于分子量較大，不能透過焦亡細胞的膜孔，但是可以穿透壞死細胞的細胞膜。作為附加優勢，EthD-2 在激活后的單核細胞內不會與其他顏色熒光染色劑共存。本研究發現新生大鼠HIBD 后壞死細胞應用EthD-2 染色后未與yo-PRO-1 和DAPI 共存，考慮與HIBD 后激活單核細胞導致炎癥介質Caspase-1、IL-1β 的釋放增多有關，此與文獻報道相符[17]。本實驗通過yo-PRO-1和EthD-2 雙染初步證實了HIE 存在焦亡現象，且應用AS-IV 預處理可減少焦亡的發生。為了深入探討新生大鼠HIBD 后機體內焦亡的發生情況和后期AS-IV 預處理對焦亡的調控情況，本次實驗還研究了焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD 的表達情況。炎性Caspase 的底物GSDMD蛋白是介導細胞焦亡的關鍵“殺手蛋白”，它是細胞焦亡的直接和最終參與者[31]。GSDMD 可靶向作用于細胞膜并且誘導在質膜中形成大的滲透性孔，因此GSDMD 被認為是形成細胞焦亡孔的候選者[32]。本研究應用AS-IV 治療后，發現AS-IV 能明顯下調GSDMD 表達。HIBD 組乳鼠損傷側腦組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達水平均明顯升高，提示HIBD 后，大鼠腦組織存在焦亡現象，應用AS-IV 治療后NLRP3、Caspase-1 表達減少，而IL-1β 干預前后無明顯變化考慮與蛋白表達延遲相關，有待進一步擴大樣本，擴大觀察時間點進一步論證。

中樞神經系統的通路通常集中在海馬，HT22細胞來源于永生化的小鼠海馬細胞系HT-4，非常適合于體外缺氧應激研究[33]。我們在動物實驗研究的基礎上，應用CCK-8 法檢測AS-IV 對缺氧損傷的HT22 細胞活力的影響，結果顯示缺氧處理后的HT22 細胞活力較對照組明顯下降，AS-IV（100～400 μmol/L）能提高OGD 組的細胞存活率，且200 μmol/L AS-IV 干預效果最好。為進一步明確AS-IV 對NLRP3 炎性小體表達的影響，我們同時檢測了不同濃度AS-IV 對HT22 細胞缺氧后焦亡相 關 因 子NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD 的蛋白水平及mRNA 表達水平的影響。結果顯示應用AS-IV 干預后，NLRP3 表達較OGD 組下降，其下游因子GSDMD、Caspase-1 和IL-1β 均明顯下調。這些結果均說明了AS-IV 對缺氧損傷的海馬神經元細胞具有一定的保護作用。

綜上所述，本研究初步證實了AS-IV 對新生大鼠HIBD 的神經保護作用。AS-IV 可以通過降低腦缺氧缺血后NLRP3 炎性小體的表達起到神經保護作用，具有一定的臨床應用前景。