加味茵陳五苓散對非酒精性脂肪肝模型大鼠miR-34a及糖異生的影響*

鄭丁，時昭紅，郭潔，張書，劉云，張曼玲

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，武漢 430022）

迄今，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）發(fā)展為世界上最常見的肝病，全球NAFLD總患病率高達(dá)25.24%，其中中東和南美國家的發(fā)病率最高（約30%），而非洲的研究報告的發(fā)病率最低（約13%）[1]。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及飲食結(jié)構(gòu)改變，NAFLD的發(fā)病率逐年增加，尤其在亞洲增長更為明顯[2-3]。在過去10年間，中國NAFLD的流行率增加了兩倍，其中上海更是（2003—2016年）從12.9%上升到43.3%[4]。NAFLD不僅僅是肝臟的疾病，而是全身代謝性疾病的中介，與高血壓病、糖尿病等密切相關(guān)，嚴(yán)重威脅人類健康。目前NAFLD的治療僅局限于飲食控制及運動，但是患者往往很難堅持目前生活方式的改變。因此，尋求藥物治療NAFLD是提高臨床療效的迫切要求。肝臟糖異生與NAFLD發(fā)生密切相關(guān)，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）是糖異生關(guān)鍵酶，PEPCK表達(dá)異常可以誘發(fā)NAFLD。研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α（PGC-1α）可激活多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控肝糖異生[5]。在前期實驗中，筆者課題組也發(fā)現(xiàn)PGC-1α可影響PEPCK的表達(dá)[6]。miR-34a是脂肪細(xì)胞分泌的微小miRNA，研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a能夠下調(diào)PGC-1α的表達(dá)[7]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療NAFLD中取得了較好的療效，茵陳五苓散出自張仲景的《金匱要略》，多項研究發(fā)現(xiàn)其治療NAFLD療效很好[8]，在前期總結(jié)時昭紅教授臨床運用茵陳五苓散加減治療脂肪肝也取得較顯著的效果，但作用機制尚不明確。

1 實驗資料

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量（200±20）g，由湖北省疾病控制中心提供。

1.2 材料 加味茵陳五苓散組成：茵陳20 g，豬苓15 g，茯苓 15 g，澤瀉 15 g，白術(shù) 15 g，桂枝 10 g，白扁豆10 g，炒麥芽15 g，生山楂15 g，陳皮10 g。生山楂可消食健脾胃，助脾恢復(fù)健運，又可活血化瘀；炒麥芽疏肝氣，又能健脾導(dǎo)滯；陳皮具有祛濕、健脾、化痰之功，與白術(shù)同用可補脾，與茯苓同用則有祛濕的作用；白扁豆能補能舒，故補而不滯也，加用白扁豆，助白術(shù)、茯苓健脾祛濕，恢復(fù)脾運化功能。

高脂飼料包括83%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+10%豬油+5%蔗糖。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥 全部實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機取10只作為正常組，余40只作為實驗組，正常組給予普通飼料，實驗組給予高脂飼料喂養(yǎng)，8周后通過肝組織病理蘇木精-伊紅（HE）染色確定造模成功后。隨機分為模型組、中藥組、中藥+空載體病毒組、中藥+慢病毒組，所有大鼠按之前飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。正常組和模型組均給予3 mL生理鹽水灌胃和200 μL生理鹽水尾靜脈注射；中藥組給予3 mL加味茵陳五苓散灌胃和200 μL生理鹽水尾靜脈注射，中藥+空載體病毒組給予3 mL加味茵陳五苓散灌胃和200 μL慢病毒尾靜脈注射；中藥+慢病毒組給予3 mL加味茵陳五苓散灌胃和200 μL miR-34a慢病毒尾靜脈注射；每日1次，連續(xù)4周。

2.2 生化指標(biāo)檢測 最后1次灌胃后禁食禁水12 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠（10 mL/kg）抽取腹主動脈血約5 mL，1 370×g離心10 min分離上層血清分裝，放-20℃冰箱保存，采用全自動生化分析儀檢測血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平。另取肝左外側(cè)葉距邊緣1 cm處取適量大小的肝組織兩塊，分別放入福爾馬林中固定和離心管中放入-20℃冰箱保存。

2.3 肝組織miR-34a、PGC-1α、PEPCK的表達(dá) 采用Trizol提取RNA后，用紫外分光光度計測定RNA的濃度，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)。PCR 引物設(shè)計：RatPGC-1αF：5’-AATGCAGCGGTCTTAGCACT-3，RatPGC-1αR：5’-GTGTGAGGAGGGTCATC，片段長度 168 bp；miR-34aF5’-TCGTGACTGGGATGCTGC-3’，R5’-TCGGCATGCATTGATTGC-3’，片段長度 158 bp；PEPCKF5’-GCAGCGGTCGAGGATGA-3’，R5’-AACCTCTATGACGGAG-3’，片段長度 145 bp；β-actinF：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，β-actin R：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’片段長度186 bp。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性50℃2 min，95℃10 min；40個循環(huán)中95℃30 s，60℃30 s，根據(jù)目的產(chǎn)物PGC-1α mRNA和內(nèi)參照β-actin CT值來反映其相對含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23．0統(tǒng)計學(xué)軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝臟病理學(xué)變化 HE染色鏡下觀，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整、肝細(xì)胞大小適中、肝細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常，肝細(xì)胞內(nèi)未見脂肪空泡；模型組及中藥+慢病毒組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞增大、排列紊亂，肝細(xì)胞可見大量大小不等脂肪空泡；中藥組及中藥+空載體病毒組肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞大小、形態(tài)未見明顯異常，肝細(xì)胞偶見少量脂肪空泡。見圖1。

圖1 各組大鼠肝脂肪變性程度Fig.1 Degree of hepatic steatosis of rats in each group

3.2 各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平 模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平均高于正常組，給予中藥干預(yù)后，中藥組血清ALT、AST、TC、TG水平均低于模型組，慢病毒過表達(dá)miR-34a后，中藥+慢病毒組大鼠與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），中藥+空載體病毒組血清ALT、AST、TC、TG表達(dá)水平較模型組均降低（P＜0．05）。見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平Tab.1 Serum ALT，AST，TC，TG levels of rats in each group

3.3 各組大鼠肝臟細(xì)胞miR-34a、PGC-1α、PEPCK mRNA的表達(dá) 模型組miR-34a mRNA表達(dá)水平高于正常組，PGC-1α、PEPCK mRNA的表達(dá)低于正常組（P＜0．05）；給予中藥干預(yù)后，中藥組 miR-34a的表達(dá)明顯低于模型組，PGC-1α、PEPCK mRNA的表達(dá)高于模型組。慢病毒過表達(dá)miR-34a后，中藥+慢病毒組 miR-34a、PGC-1α、PEPCK mRNA 的表達(dá)較模型組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）；與模型組比較，中藥+空載體病毒組的miR-34a mRNA表達(dá)明顯降低，PGC-1α、PEPCKmRNA 的表達(dá)明顯升高（P<0.05）。見表2。

表2 不同組別大鼠miR-34a、PGC-1αand PEPCK mRNA的表達(dá)Tab.2 The mRNA expressions of miR-34a，PGC-1αand PEPCK of rats in different groups

4 討論

MicroRNA（miRNA）是一種能夠調(diào)控下游基因的短鏈非編碼RNA，廣泛參與機體生理和病理過程[9]。肝細(xì)胞脂肪蓄積以及肝細(xì)胞的炎性破壞具有很強的遺傳性，因此NAFLD的發(fā)生和進(jìn)展也受到表觀遺傳因素的調(diào)控。其中miRNA通過與許多互補的靶mRNA結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄后水平在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮很大作用，其失調(diào)已被證明大量實驗研究表明miRNA的表達(dá)異常對NAFLD具有較高的預(yù)后和預(yù)測價值[10-11]。越來越多的證據(jù)表明，脂質(zhì)沉積是NAFLD發(fā)生的關(guān)鍵因素[12]。miRNA在肝臟脂質(zhì)沉積中發(fā)揮重要作用[13]。目前，大量研究證實miR-34a在NAFLD中肝細(xì)胞中表達(dá)異常，提示miR-34a可能是NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中重要因子[14]。在本次實驗研究中，模型組大鼠肝臟miR-34a的表達(dá)明顯高于正常組大鼠。

PEPCK是糖異生關(guān)鍵酶，參與調(diào)節(jié)肝臟糖異生，下調(diào)PEPCK的表達(dá)可抑制肝臟糖異生[15]。在前期實驗研究中，本課題組證實提高PGC-1α的含量能夠激活PEPCK的表達(dá)[16]。在本次研究中，模型組中PGC-1α和PEPCK的表達(dá)均明顯低于正常組，通過加味茵陳五苓散干預(yù)后，提高PGC-1α的表達(dá)后，PEPCK的表達(dá)也增加。

中醫(yī)認(rèn)為，“痰”“瘀”乃NAFLD的關(guān)鍵病理因素，痰瘀之邪漸積于肝，久不得散則痞塊乃成肝癖，治療上通常以“祛痰降濁、活血化瘀”為則，但臨床上部分患者療效仍不盡理想。葉天士認(rèn)為陽氣不通乃痰濁、瘀血停聚的根本病機，于是提出“陽氣窒閉，濁陰凝瘡”。辛溫通陽之品易助熱，對于濕熱之證，葉天士采用利小便去濕，濕去則熱孤，陽氣則通。本研究中，中藥組miR-34a表達(dá)明顯低于模型組以及PGC-1α和PEPCK的表達(dá)高于模型組，說明加味茵陳五苓散能降低大鼠miR-34a的表達(dá)和促進(jìn)PGC-1α和PEPCK的表達(dá)。使用慢病毒過表達(dá)miR-34a后，中藥+慢病毒組miR-34a、PGC-1α和PEPCK的表達(dá)與模型組無統(tǒng)計學(xué)差異，說明過表達(dá)miR-34a后，加味茵陳五苓散不能發(fā)揮改善肝脂肪變性的作用，而中藥+空載體病毒組miR-34a、PGC-1α和PEPCK的表達(dá)與中藥組無統(tǒng)計學(xué)差異，說明加味茵陳五苓散通過降低miR-34a的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)PGC-1α和PEPCK的表達(dá)。

綜上所述，加味茵陳五苓散能夠通過降低miR-34a的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)PGC-1α、PEPCK的表達(dá)，促進(jìn)糖異生，減少肝臟脂質(zhì)沉積，以改善NAFLD肝細(xì)胞脂肪變性。