基于GRP78-ATF6-CHOP通路研究雷公藤多苷對壞死性小腸結腸炎新生大鼠的影響*

高鵬，周鳳蕊，劉俊華，周川

1.鄭州市第六人民醫院，河南 鄭州450015；2.鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州450000

壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是臨床常見的新生兒急重癥，尤其是早產兒、低體質量兒發病率更高，已成為導致新生兒死亡的重要疾病之一［1-3］。NEC以小腸、結腸彌漫性或局部壞死為典型特征，至今尚無有效的治療手段，探討其發病機制，尋找有效干預手段對改善NEC預后有重要臨床意義。研究表明，除腸道菌群紊亂外，腸道促炎及抗炎因子失衡與NEC發生、發展關系密切［4-5］。隨著對中醫藥研究的深入，發現中藥在抗炎、調節機體免疫方面發揮著重要作用。雷公藤是臨床常用的活血化瘀、解毒消腫藥物，其主要活性成分雷公藤多苷已被證實具有抗炎和免疫調節作用［6-8］。雷公藤多苷常用于治療潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎等炎癥性疾病［9-10］，但其對NEC的研究較少。本研究應用新生大鼠人工喂養聯合缺氧冷刺激的方法建立NEC模型，觀察不同劑量的雷公藤多苷對其腸道菌群的影響，并探討具體的調控機制，為臨床新生兒NEC的治療提供依據。

1 材料

1.1 動物SPF級SD新生大鼠55只，雌雄不限，1～2日齡，體質量5～10 g，由鄭州大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（豫）2018-0001。飼養于12 h／12 h明暗交替，24～26℃，相對濕度（55±1）%條件下。實驗操作符合動物倫理學，倫理號：2019005703127。

1.2 藥物及試劑雷公藤多苷片（江蘇美通制藥有限公司，批號：20190320）；雅培嬰兒配方奶粉、雅培蛋白粉（美國雅培公司，批號分別為：57713T26、61485C15）；脂肪乳（德國費森尤斯卡比華瑞制藥有限公司，批號：20203927）；白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國R＆D公司，批號分別為：VAL601、M600B、ML-Elisa-1421）；BCA蛋白定量分析試劑盒（美國Thermo公司，批號：23209）；兔抗大鼠葡萄糖調節蛋白78（GRP78）單抗、兔抗大鼠激活轉錄因子6（ATF6）多抗、兔抗大鼠增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）單抗（美國Abcam公司，批號分別為：ab21685、ab203119、ab194533）；山羊抗兔GRP78、ATF6、CHOP單抗（美國Abcam公司，批號分別為ab227865、ab37149、ab265760）。

1.3 儀器SM2235型徠卡切片機（德國徠卡顯微系統貿易有限公司），3550UV型酶標儀、Powerpac Universal通用型電泳儀（美國Bio-rad公司）。

2 方法

2.1 NEC模型建立取55只新生大鼠，出生48 h后與母鼠分離，放置保育箱中，給予配方奶（雅培嬰兒配方奶粉4.741 g+雅培蛋白粉9.5 g+200 g·L-1的脂肪乳48.8 mL，雙蒸水補充至100 mL）喂養。首次給予0.2 mL，每3 h給予1次，隨后每24 h增加0.1 mL，連續喂養3 d。隨機選取45只新生大鼠每天早晚人工喂養后給予缺氧+冷刺激［11］：新生鼠放入自制缺氧箱，控制N2流量為15 L·min-1，測氧儀顯示O2濃度為0時開始計時，維持90 s后關閉輸N2閥門，立即取出新生鼠，放置于4℃冰箱中，持續10 min，連續3 d，每天2次。以排黃綠色黏液稀便、體質量減輕為造模成功標志。10只新生大鼠僅母鼠分離、人工喂養，不作缺氧+冷刺激。

2.2 動物分組及干預取造模成功大鼠38只，采用體質量排序法隨機分為4組，分為模型組9只、雷公藤多苷低劑量組9只、雷公藤多苷中劑量組10只，雷公藤多苷高劑量組10只；另10只僅母鼠分離、人工喂養的新生大鼠，設為對照組。造模結束次日，給予雷公藤多苷低劑量組、中、高劑量組新生大鼠分別灌胃9 mg·kg-1、18 mg·kg-1、27 mg·kg-1的雷公藤多苷片混懸液（灌胃前用生理鹽水配制為0.1 mL的混懸液），其中雷公藤多苷劑量是按照人與大鼠體表面積換算的等效劑量［12］，對照組和模型組灌胃0.1 mL的生理鹽水，每天1次，連續7 d。

2.3 標本采集末次灌胃結束后禁食12 h期間留取各組糞便樣本1 g進行細菌學檢查；禁食12 h后，脫頸法處死各組新生大鼠，立即剖腹取回盲部近端腸管約2 cm，PBS沖洗干凈后隨機分為兩部分，一部分置于4%的中性甲醛中固定備用，另一部分儲存于液氮中保存備用。

2.4 腸道組織病理學檢查取固定于4%的中性甲醛中的腸道組織，常規石蠟包埋，制作厚度為4μm的連續切片，取切片進行脫蠟、水化步驟，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色。于光學顯微鏡下觀察病理改變，并采用雙盲法進行腸組織損傷評分［11］：腸絨毛膜及組織結構正常，記0分；黏膜下和（或）固有層輕度分離，記1分；黏膜下和（或）固有層中度分離，黏膜下和（或）固有層水腫，記2分；黏膜下和（或）固有層重度分離，黏膜下和（或）固有層水腫，局部腸絨毛膜脫落，記3分；腸絨毛膜完全脫落且伴腸壞死，記4分。每張切片隨機取3個視野評分，取平均值。

2.5 腸道菌群分析取各組糞便樣本，稀釋液1∶10進行稀釋，在無菌玻璃片上均勻涂布1 cm×1 cm區域，自然晾干后，在酒精燈上烤片固定，進行常規革蘭氏染色［13］，于光學顯微鏡下（10×100倍）對細菌總數、革蘭氏陽性（G+）桿菌、革蘭氏陰性（G-）桿菌、G+球菌、G-球菌進行計數，每張切片隨機取3個視野計數，取平均值。

2.6 檢測腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平取儲存于液氮中的腸組織50 mg，加入1 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.0），剪碎后進行超聲勻漿，4℃離心半徑12 cm，2 500 r·min-1離心15 min，取組織上清液，采用ELISA檢測腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，按照說明書步驟進行操作，于酶標儀上檢測待測樣本光密度值，并根據標準曲線計算待測樣本濃度。

2.7 GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達量的檢測取儲存于液氮中的腸組織50 mg，液氮中研磨，轉移至離心管，加入1 mL的組織裂解液，冰上孵育30 min，4℃預冷離心機12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，采用BCA法測定總蛋白量。取50μg樣本進行SDS-PAGE，電泳分離后，將條帶轉移至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉2 h，均加入1∶500稀釋的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，暗室中顯色。應用凝膠成像系統掃描，ImageJ軟件分析各條帶灰度值，計算GRP78、ATF6、CHOP條帶灰度值與內參GAPDH灰度值的比值。

2.8 統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件分析數據，計量資料均以均數±標準差（±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 新生大鼠一般情況對照組新生大鼠進奶量、排便、活動情況等均正常，試驗期間無死亡；模型組新生大鼠出現進奶量減少、消瘦、懶動、反應遲鈍、腹脹、腹瀉、排黃綠色黏液稀便等情況；雷公藤多苷各劑量組上述情況均有所改善，且雷公藤多苷高劑量組改善最為明顯。

3.2 腸組織病理學觀察及組織損傷評分比較對照組大鼠腸黏膜上皮連續、完整，結構正常；模型組絨毛水腫、脫落、結構消失，固有層及黏膜下層大量炎性細胞浸潤；雷公藤多苷各劑量組絨毛水腫、脫落現象減輕，結構趨于正常，炎性細胞浸潤量減少，雷公藤多苷高劑量組上述病變最輕，但仍有少量炎性細胞浸潤。對照組、模型組和雷公藤多苷低、中、高劑量組腸組織損傷評分分別為（0.41±0.08）分、（3.20±0.62）分、（2.51±0.42）分、（2.15±0.34）分、（1.67±0.21）分，與對照組比較，模型組腸組織損傷評分均升高（t＝14.145，P＜0.001）；與模型組比較，雷公藤多苷低、中及高劑量組腸組織損傷評分均降低（t＝2.764、5.087、7.368，P＝0.014、＜0.001、＜0.001）；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組腸組織損傷評分均降低（t＝2.636、5.606，P＝0.017、＜0.001），且雷公藤多苷高劑量組低于中劑量組（t＝3.007，P＝0.008）。見圖1。

3.3 腸桿菌總數、腸球菌總數及桿／球菌比值比較與對照組比較，模型組腸桿菌總數、桿／球菌比值降低，腸球菌總數明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組腸桿菌總數、桿／球菌比值升高，腸球菌總數明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組腸桿菌總數、桿／球菌比值升高，腸球菌總數明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷中劑量組比較，雷公藤多苷高劑量組腸桿菌總數、桿／球菌比值升高，腸球菌總數降低（P＜0.05）。見表1。

圖1 腸組織病理學觀察（HE，×200）

表1 腸桿菌總數、腸球菌總數及桿／球菌比值比較 （±s）

表1 腸桿菌總數、腸球菌總數及桿／球菌比值比較 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與雷公藤多苷低劑量組比較，△P＜0.05；與雷公藤多苷中劑量組比較，▲P＜0.05

組別n 腸桿菌總數／個 腸球菌總數／個 桿／球菌比值對照組10 181.59±17.36 65.70±7.31 2.76±0.24 模型組9 110.44±9.58*205.38±19.88*0.54±0.08*雷公藤多苷低劑量組 9 125.27±13.07＃ 180.01±19.20＃0.70±0.09＃雷公藤多苷中劑量組 10 141.08±14.22＃△ 158.36±17.35＃△0.89±0.11＃△雷公藤多苷高劑量組 10 156.31±15.94＃△▲122.47±15.32＃△▲ 1.28±0.16＃△▲F值34.980 106.974 346.237 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3.4 腸道G+桿菌、G+球菌占總菌群數比率比較與對照組比較，模型組G+桿菌比率明顯降低，G+球菌比率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組G+桿菌比率明顯升高，G+球菌比率明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組G+桿菌比率明顯升高，G+球菌比率明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷中劑量組比較，雷公藤多苷高劑量組G+桿菌比率明顯升高，G+球菌比率明顯降低（P＜0.05）。見表2。

3.5 腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較與對照組比較，模型組IL-6水平明顯降低，IL-1β、TNF-α明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組IL-6水平明顯升高，IL-1β、TNF-α明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組IL-6水平明顯升高，IL-1β、TNF-α明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷中劑量組比較，雷公藤多苷高劑量組IL-6水平明顯升高，IL-1β、TNF-α明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表2 腸道G+桿菌、G+球菌占總菌群數比率比較 （±s，%）

表2 腸道G+桿菌、G+球菌占總菌群數比率比較 （±s，%）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與雷公藤多苷低劑量組比較，△P＜0.05；與雷公藤多苷中劑量組比較，▲P＜0.05

組別n G+桿菌比率G+球菌比率對照組10 60.54±5.97 19.36±2.07模型組9 29.88±3.51*51.20±5.22*雷公藤多苷低劑量組 9 35.30±4.10＃44.54±4.35＃雷公藤多苷中劑量組10 41.26±5.11＃△36.83±3.16＃△雷公藤多苷高劑量組10 49.55±5.24＃△▲30.17±3.22＃△▲F值58.023 106.410 P值＜0.001＜0.001

表3 腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 （±s，ng·L-1）

表3 腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 （±s，ng·L-1）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與雷公藤多苷低劑量組比較，△P＜0.05；與雷公藤多苷中劑量組比較，▲P＜0.05

組別n IL-1βIL-6 TNF-α對照組10 52.33±7.21 105.91±8.30 26.15±6.77 模型組9 262.07±20.66*26.32±3.11*315.49±21.83*雷公藤多苷低劑量組9 201.54±18.73＃51.64±6.54＃231.02±20.26＃雷公藤多苷中劑量組 10 168.78±15.21＃△60.27±6.34＃△175.10±19.37＃△雷公藤多苷高劑量組 10 131.19±15.09＃△▲72.33±6.75＃△▲94.37±10.22＃△▲F值232.762 193.150 442.447 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3.6 腸組織中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達量比較與對照組比較，模型組GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達量均降低（P＜0.05），且雷公藤多苷中劑量組低于高劑量組。見表4，圖2。

表4 腸組織中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達量比較 （±s）

表4 腸組織中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達量比較 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與雷公藤多苷低劑量組比較，△P＜0.05；與雷公藤多苷中劑量組比較，▲P＜0.05

GRP78 ATF6 CHOP對照組組別n 10 0.41±0.06 0.38±0.04 0.14±0.03 模型組9 2.06±0.18*1.49±0.12*1.35±0.16*雷公藤多苷低劑量組 9 1.11±0.11＃1.10±0.11＃1.13±0.12＃雷公藤多苷中劑量組 10 0.85±0.09＃△0.83±0.08＃△0.92±0.08＃△雷公藤多苷高劑量組 10 0.62±0.07＃△▲0.60±0.07＃△▲ 0.65±0.09＃△▲F值326.753 231.944 197.043 P值 ＜0.001＜0.001＜0.001

圖2 腸組織中GRP78、ATF6、CHOP蛋白表達

4 討論

NEC是新生兒危重癥，多在出生后3周內發病，以腸道局部壞死為臨床特征，易導致腸穿孔［14］。外科手術結合常規對癥治療是主要干預手段，但治療效果仍需進一步提高［15-16］。目前NEC發病機制尚未完全闡明，認為與早產、人工喂養、腸道菌群紊亂等多種因素有關，闡明NEC發病機制并尋找有效治療方法有重要意義［17-18］。雷公藤多苷是中藥雷公藤的有效活性成分，可通過調節體液免疫、細胞免疫參與機體炎癥反應［19］。研究雷公藤多苷對NEC新生大鼠的干預效果及作用機制，可為雷公藤多苷進一步應用于臨床提供依據。

臨床中手術切除的新生兒腸道組織標本，因伴有嚴重壞死及非特異性炎癥病變，不適合對疾病早期病變的研究［20］。人工喂養聯合缺氧冷刺激復制NEC模型，其腸道損傷病理改變過程與人類相似［21］，本研究應用該方法建立NEC新生大鼠模型。結果顯示造模大鼠出現腹脹、腹瀉、排黃綠色黏液稀便等NEC典型癥狀，腸道病理改變與臨床相似。機體腸道菌群多種多樣，如雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等G+桿菌等生理性優勢菌群，腸球菌、鏈球菌等G+球菌及擬桿菌、大腸埃希菌等G-桿菌，屬條件致病菌，另外葡萄球菌、假單胞菌等多屬于G-桿菌和G+球菌，屬有害病原菌［22-23］。胎兒腸道無菌，新生兒在出生數小時內腸道細菌迅速定植和生長，達到平衡狀態，使桿球菌比值維持在3左右，喂養方式、缺氧、寒冷等刺激因素均可引起腸道菌群定植紊亂［24］。本研究中模型組腸道桿球菌比值約0.54，優勢菌群G+桿菌比率降低、條件致病菌或病原菌G+球菌比率升高，應用不同劑量雷公藤干預后桿球菌比值、G+桿菌比率均得到顯著提高，G+球菌比率降低，提示NEC新生大鼠的腸道菌群紊亂現象得到糾正。此外，本研究應用不同劑量雷公藤多苷干預后，各干預組較模型組腸組織損傷評分、腸組織IL-1β、TNF-α水平呈劑量依賴性降低，而腸組織IL-6水平呈劑量依賴性升高，說明雷公藤多苷有助于調節NEC新生大鼠的腸道炎癥反應。研究顯示，腸道菌群紊亂后，條件致病菌及病原菌產生的毒素可引起黏膜完整性破壞、炎癥細胞浸潤等一系列病理改變，腸道發生嚴重炎癥病變［25］。艾燕等［26］研究表明，雷公藤多苷可通過抑制腸組織中TNF-α等促炎因子水平發揮治療潰瘍性結腸炎大鼠炎癥反應作用；欽丹萍等［27］研究顯示，雷公藤多苷可有效緩解克羅恩病、潰瘍性結腸炎患者腸道炎癥反應，與本研究結果相似。NEC發病后腸黏膜完整性被破壞，病原菌異位，引起內源性促炎介質大量釋放，雷公藤通過抑制促炎介質釋放，促進抗炎介質分泌，發揮保護腸黏膜完整性作用。

本研究中，雷公藤多苷各劑量組腸組織中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達量呈劑量依賴性降低，說明雷公藤多苷可能通過抑制GRP78-ATF6-CHOP通路發揮調控作用。GRP78是主要分布于內質網中的熱休克蛋白，參與內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ESR）穩態調節［28］。生理狀態下，GRP78與下游ATF6結合處于非激活狀態，當ESR啟動后，兩者發生解離，ATF6隨之活化進入細胞核，激活位于下游的靶基因CHOP轉錄和翻譯，啟動細胞凋亡等過程［29］。喂養不當、缺氧等多種高危因素作用下，腸道ESR增加，GRP78-ATF6-CHOP通路激活，從而啟動細胞凋亡通路，加之腸道微生態失衡釋放大量腸毒素，進一步加劇腸道上皮細胞凋亡，促進腸組織損傷［30］。由此可知，雷公藤多苷可能通過抑制GRP78-ATF6-CHOP通路，緩解腸組織上皮細胞凋亡現象，從而發揮保護NEC腸組織作用。

綜上所述，雷公藤多苷可有效改善NEC新生大鼠的腸道菌群紊亂現象，且可能通過抑制GRP78-ATF6-CHOP通路發揮保護腸組織的作用，為臨床雷公藤多苷用于NEC的防治提供理論參考。