參附注射液對大鼠阿霉素心肌損傷的影響*

王宏波，楊冬梨，徐宗佩，李玉紅

天津中醫藥大學，天津300193

阿霉素（doxorubicin，DOX）屬于第二代蒽環類高效廣譜抗腫瘤抗生素，臨床廣泛應用于血液系統惡性腫瘤和實體腫瘤的治療［1-3］，但因其出現的劑量依賴性心臟毒性，限制了其臨床應用［4-5］。研究表明，線粒體是DOX心臟損傷最主要的細胞器，DOX誘導的心臟功能紊亂主要是線粒體損傷和功能障礙［6］。作為許多生理生化過程必不可少的場所，如氧化磷酸化、三羧酸循環、脂肪酸的β-氧化、鈣處理和血紅素生物合成等，線粒體在細胞代謝中起著中心調節的作用［7］。線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）開放被認為是造成DOX心肌線粒體損傷的決定因素［8］。以抑制mPTP開放，降低線粒體腫脹為主的線粒體途徑干預DOX心臟毒性成為心肌保護藥物的研究熱點。

參附注射液（shenfu injection，SFI）源自《校注婦人良方》之參附湯，由紅參和黑附片提取物制成，主要含有人參皂苷和烏頭類生物堿［9］，具有益氣固脫、振奮心陽之功效，是心血管系統疾病的臨床常用藥物，具有很好的心肌保護作用［10-15］。臨床及動物實驗研究［16-17］均表明，SFI能改善腫瘤患者放化療后的生活質量，減輕阿霉素的心臟損傷但不降低其療效，常作為腫瘤患者放化療后的輔助用藥［18-19］。本實驗采用皮下注射DOX誘導大鼠心肌損傷，旨在觀察SFI是否能通過改善心肌線粒體呼吸功能障礙，減輕DOX的心臟損傷，從線粒體角度探討其潛在的機制。

1 材料

1.1 動物清潔級健康SD雄性大鼠，6～8周齡，體質量為220～240 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證編號：SCXK（京）2012-0001。飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所，室溫20～25℃，相對濕度40% ～60%，并以實驗動物中心標準飼料進行喂養。動物倫理審核編號：TCM-LAEC2019042。

1.2 藥物與試劑SFI（雅安三九藥業有限公司，批號：20043116）；阿霉素（深圳萬樂藥業有限公司，批號：H44024359）；9 g·L-1氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號：20181206）。

1.3 儀器Oxygraph-2k型線粒體呼吸測量儀（奧地利Oroboros公司）；INFINITEF50型多功能讀板機（瑞士TECAN公司）；JA1003型電子分析天平（上海天平儀器）；臺式冷凍離心機（美國Thermo公司）；DW-86L38型立式超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）；Vevo2100TM型超高分辨率小動物超聲實時影像系統（加拿大Visual Sonics公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥方法SD雄性大鼠按體質量隨機分為5組，每組12只，分別為空白（SAL）組、空白參附（SAL+SFI，5 mL·kg-1）組、模型（DOX）組、參附高劑量（DOX+SFI，5 mL·kg-1）組、參附低劑量（DOX+SFI，1 mL·kg-1）組。DOX組及DOX+SFI組給予皮下注射阿霉素（2 mg·kg-1），每周1次，共7周，建立心臟損傷模型［20-21］。停止注射DOX后1周處死動物。SAL組給予等容積的無菌生理鹽水，加用SFI組在DOX損傷前一天開始腹腔注射SFI，持續給藥5 d，大鼠在造模和給藥過程中均未出現死亡，確保每組最終大鼠數量12只。

2.2 心臟生化指標的檢測最后一次給予阿霉素或生理鹽水后第7天，麻醉大鼠，仰臥體位，快速打開胸腔，取出心臟，沖洗、拭干，稱其體質量。分離約20～25 mg的心肌組織，在20 mmol·L-1的Tris／KCl勻漿液中低溫勻漿，3 000 g離心10 min，上清液儲存于-80℃冰箱用于生化檢測。心臟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）用WST-8法進行檢測。

2.3 心臟線粒體的制備采用差速分級離心法分離心肌線粒體。將大鼠心肌組織剪為碎塊放入玻璃勻漿器內，加入冰水預冷的勻漿介質，0℃冰浴研磨組織，將組織勻漿物轉移到離心管，1 000×g離心5 min；取上清，1 000×g再次離心5 min；取上清12 000 g離心10 min，線粒體沉淀在管底，棄上清，取沉淀，加入冰水預冷的store buffer，混懸線粒體，所有離心均在4℃進行。用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白含量，制備的線粒體4 h內用于實驗。

2.3.1 線粒體呼吸功能的測定使用細胞呼吸測量儀檢測線粒體呼吸，根據氧耗曲線，記錄態Ⅲ和態Ⅳ呼吸速率，并計算態Ⅲ與態Ⅳ的呼吸速率（nmolO2·min·mg pro-1）之比，即為線粒體呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）。

2.3.2 線粒體腫脹的檢測線粒體腫脹以線粒體在200μmol·L-1的CaCl2作用下腫脹產生的吸光度（A520）變化值表征。取線粒體用線粒體腫脹液稀釋至0.5 g·L-1，在25℃下取200μmol·L-1的CaCl2作用于線粒體，10 min內觀察在520 nm處線粒體吸光度的變化值，該變化反映線粒體腫脹程度，提示mPTP的開放情況。

2.4 統計方法采用SPSS 24.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，單因素方差分析及LSD-t檢驗進行統計學處理。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 體質量、心臟質量及心臟指數與SAL組比較，DOX組大鼠體質量及心臟質量明顯降低（P＜0.05），心臟指數有下降趨勢（P＞0.05）；與DOX組比較，參附高低劑量組大鼠體質量、心臟質量、心臟指數有升高趨勢（P＞0.05）。見表1。

表1 SFI對大鼠體質量、心臟質量及心臟指數的影響 （±s，n＝12）

表1 SFI對大鼠體質量、心臟質量及心臟指數的影響 （±s，n＝12）

注：與SAL組比較，*P＜0.05

組別 體質量／g心臟質量／g 心臟指數SAL組514.22±23.59 1.38±0.09 2.68±0.17 SAL+SFI5組 522.22±27.45 1.38±0.07 2.62±0.11 DOX組381.00±13.00* 1.04±0.05* 2.61±0.40 DOX+SFI5組 386.17±24.79 1.10±0.06 2.65±0.26 DOX+SFI1組408.00±25.15 0.97±0.06 2.66±0.33

3.2 線粒體呼吸及腫脹與SAL組比較，DOX組大鼠線粒體態Ⅲ呼吸速率明顯降低（P＜0.05），心臟線粒體更容易腫脹；與DOX組比較，參附高劑量組大鼠的線粒體態Ⅲ呼吸速率有升高趨勢，也有降低線粒體腫脹的趨勢（P＞0.05）。SFI對正常大鼠RCR有升高的趨勢，DOX損傷后RCR下降，SFI對DOX造成的RCR下降有一定的改善作用。見表2。

表2 SFI對線粒體呼吸的影響 （±s，n＝12）

表2 SFI對線粒體呼吸的影響 （±s，n＝12）

注：與SAL組比較，*P＜0.05

組別 態Ⅲ 態ⅣRCR 腫脹SAL組429.39±115.20 72.16±26.65 4.70±0.71 0.035±0.017 SAL+SFI5組 403.23±187.36 67.93±32.75 5.51±1.82 0.027±0.006 DOX組241.05±80.84* 85.13±36.82 4.29±0.39 0.043±0.014 DOX+SFI5組 300.06±158.70 82.53±29.86 4.74±0.75 0.031±0.009 DOX+SFI1組 226.90±66.80 77.89±50.80 4.81±0.98 0.043±0.018

3.3 SFI對心肌SOD活性的影響與SAL組比較，DOX組大鼠心臟T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD與SAL組比較，無明顯變化（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX+SFI5組心臟CuZn-SOD明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表3 SFI對心肌SOD活性的影響 （±s，n＝12）

表3 SFI對心肌SOD活性的影響 （±s，n＝12）

注：與DOX組比較，*P＜0.05

T-SOD CuZn-SOD Mn-SOD SAL組組別15.89±0.87 5.07±0.70 10.82±1.19 SAL+SFI5組16.64±0.83 4.82±1.16 11.75±1.37 DOX組16.85±0.41 5.13±0.71 11.72±0.91 DOX+SFI5組16.55±0.49 6.29±1.48* 10.25±1.43 DOX+SFI1組15.53±1.20 7.42±2.65*8.11±3.24

4 討論

mPTP是存在于線粒體內外膜之間的一種非特異性通道，是線粒體內外信息交流的重要樞紐。mPTP是由多種蛋白質組成的復合體，根據細胞環境不同，mPTP有3種開放狀態：①完全關閉狀態，線粒體跨膜電位（△Ψm）穩定；②可逆的低水平開放狀態，僅允許相對分子量小于300Da的物質通過，△Ψm可逆性降低；③不可逆的高水平開放狀態，使相對分子質量小于1 500 Da的物質通過線粒體內膜，△Ψm不可逆的降低［22］。當心肌細胞遭受損傷時，線粒體mPTP開放是導致線粒體功能障礙、誘導細胞凋亡和壞死的主要因素［23］。眾多研究證實，mPTP開放引起的線粒體腫脹、破裂是引起心肌缺血再灌注損傷的關鍵因素，缺血心肌的功能恢復也與mPTP開放程度相關，故抑制其開放成為心肌保護作用的最終效應器［24］。

研究表明，DOX誘導的心臟功能紊亂主要與線粒體的損傷及其相關的氧化損傷和凋亡相關［25-27］，其心臟毒性的病理生理機制主要是損傷了線粒體復合物Ⅰ的氧化還原反應，導致氧化應激反應增加，線粒體呼吸和磷酸化被抑制，干擾了細胞內的鈣穩態［28］。線粒體鈣超載及氧化應激是誘導mPTP開放的主要因素，而阿霉素造成心臟線粒體氧化應激及細胞內鈣紊亂，形成了有利于mPTP開放的條件，最終導致mPTP開放、線粒體損傷。mPTP的開放伴隨著線粒體膜電位降低，線粒體膨脹、外膜破裂和一系列前凋亡因子的釋放，最終導致細胞凋亡［23］。有研究報道，SFI具有降低內毒素血癥大鼠腸上皮細胞線粒體膜電位的作用［29］。RCR是評價線粒體結構和功能完整性及氧化磷酸化效率的重要指標。本實驗結果顯示，阿霉素促進mPTP的開放導致大鼠心臟線粒體腫脹，抑制大鼠心臟線粒體態Ⅲ呼吸，降低了RCR。給予SFI后，上述指標有一定程度改善，說明SFI具有一定的保護心肌細胞線粒體免受阿霉素損傷的作用。

SOD通過把有害的超氧自由基轉化為過氧化氫和氧氣，而后在過氧化氫酶和過氧化物酶的作用下將過氧化氫分解為水，從而起到清除自由基的作用。有研究報道SFI能夠增加大鼠心肌SOD含量、減少丙二醛（malondialdehyde，MAD）含量、抑制蛋白凋亡，從而改善心力衰竭大鼠氧化應激水平［30］。亦有研究發現，SFI可明顯改善阿霉素所致心衰大鼠的心功能，保護機制可能與抗氧化及降低血管緊張素Ⅱ的含量有關［31］。本研究發現，SFI有升高大鼠心肌CuZn-SOD的趨勢，表明SFI可能通過增強SOD活性而發揮抗氧化作用起到心臟保護的作用。

綜上所述，阿霉素抑制了大鼠心肌線粒體呼吸功能，高劑量的SFI可改善阿霉素損傷大鼠的線粒體腫脹程度，升高CuZn-SOD，但SFI抗阿霉素心臟毒性機制研究還需要進一步探索。