苦參堿對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)及血小板中精氨酸酶和腺苷核苷酸水解酶活性的影響*

孟京紅，嚴(yán)力軍，李敏，樂(lè)曉丹，尹偉平

1.襄陽(yáng)市中心醫(yī)院，湖北 襄陽(yáng)441003；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，湖北 武漢430061

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種影響關(guān)節(jié)的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其特征是滑膜炎、滑膜組織增生、軟骨和骨質(zhì)破壞，嚴(yán)重者可導(dǎo)致身體殘疾［1］。目前，雖已明確RA是主要由T細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞介導(dǎo)的疾病［2-3］，但缺乏有效、可靠且毒性低的RA治療策略。臨床常用糖皮質(zhì)激素（如地塞米松）、抗風(fēng)濕藥物（如甲氨蝶呤）和非甾體類抗炎藥物（如布洛芬）緩解RA的炎癥反應(yīng)［4］，然而長(zhǎng)期使用這些藥物會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，如胃腸道潰瘍、骨髓抑制、心臟病等。苦參堿（matrine）是傳統(tǒng)中藥苦參中最重要的生物堿之一，具有抗炎、抗癌和抗氧化等藥理功能［5-8］。角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（carrageenan-induced arthritis，CIA）模型是用于研究急性和慢性炎癥狀態(tài)的模擬人RA最為真實(shí)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?-10］。嘌呤能信號(hào)傳導(dǎo)是免疫系統(tǒng)處理炎癥和免疫反應(yīng)的機(jī)制之一。因此，嘌呤能信號(hào)分子可能有益于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［11］。本文主要研究苦參堿對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)及血小板中精氨酸酶和腺苷核苷酸水解酶活性的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物120只體質(zhì)量為180～200 g的雌性Wistar大鼠，購(gòu)自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證號(hào)：SYXK（川）2017-203。大鼠在25℃，12 h光照／12 h黑暗循環(huán)的飼養(yǎng)室，自由獲取水和食物。

1.2 藥物與試劑苦參堿（HPLC≥95%，上海谷研生物有限公司，貨號(hào)：G0Y011597）；地塞米松（上海聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號(hào)：D1756）；角叉菜膠（北京鼎豐基業(yè)生物科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)：Sigma-C1013）；干擾素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）抗體（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab224197）；白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）抗體（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab246802）；IFN-γ、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、IL-4、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（上海聯(lián)碩生物刻科技有限公司，貨號(hào)分別為：ml002833-1、ml037351-1、ml102825-1、ml037361、ml002813-1、ml002859）；RIPA裂解緩沖液（南京海克爾生物科技有限公司，貨號(hào)：SBJ-0999）；BCA試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司，貨號(hào)：BC201）；p65抗體、p-IKBα抗體、IKBα抗體（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab16502、ab133462、ab32518）。

1.3 儀器BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯光學(xué)有限公司）；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Synergy HT型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermofisher Scientific公司）；mini protean 3 cell型電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；GDS-800 UVP型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）。

2 方法

2.1 模型構(gòu)建及給藥角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型構(gòu)建［12］：隨機(jī)分為正常組（20只）和關(guān)節(jié)炎組（100只），關(guān)節(jié)炎組在右側(cè)脛骨-股骨關(guān)節(jié)內(nèi)注射20μL的1%角叉菜膠（生理鹽水配制），每日1次，持續(xù)7 d。正常組同一位置注射等量生理鹽水。在第7天，確認(rèn)關(guān)節(jié)炎模型建立情況。從第8天起，每天分別灌胃20 mg·kg-1、40 mg·kg-1、80 mg·kg-1的苦參堿［11］或0.2 mg·kg-1地塞米松［11］，連續(xù)21 d。在給藥第0天、7天、14天、21天分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量各大鼠爪厚度，并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，然后處死大鼠并收集組織和血液用于分析。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)按照Z(yǔ)heng等［13］關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定各組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)：0分：未受影響；1分：影響1種關(guān)節(jié)類型；2分：影響2種關(guān)節(jié)類型；3分：影響3種關(guān)節(jié)類型；4分：影響3種以上關(guān)節(jié)類型。

2.2.2 HE染色觀察軟骨損傷將軟骨組織用石蠟包埋切片，按照HE染色步驟進(jìn)行染色：切片脫蠟、水洗、蘇木精液染色、水洗；用1% 鹽酸酒精分化，水洗；0.6%氨水返藍(lán)，水洗；0.5%伊紅液染色，水洗；脫水，二甲苯透明；中性樹(shù)膠封片；在400倍顯微鏡下觀察軟骨組織損傷情況。

2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定大鼠外周血T細(xì)胞的功能表型分離外周血單核細(xì)胞，用磁性微珠通過(guò)陰性選擇進(jìn)一步純化CD4+T細(xì)胞，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。用PMA和離子霉素刺激細(xì)胞4 h，并用IFN-γ或IL-4熒光綴合抗體染色。采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析IFN-γ+或IL-4+T細(xì)胞的百分比。

2.2.4 ELISA法測(cè)定大鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的水平將樣品加入各反應(yīng)孔，37℃反應(yīng)45 min；用洗滌液洗滌4次，再加入生物素標(biāo)記的抗體，在37℃孵育30 min；洗滌后加鏈霉親和素-HRP 混合均勻，在37℃ 反應(yīng)30 min；加入顯色劑避光顯色；加終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果。

2.2.5 評(píng)估精氨酸酶活性將pH 9.5的4 mmol·L-1Tris-HCl緩 沖 液250 μL、5 mmol·L-1MnCl2200μL、0.2 mol·L-1精氨酸溶液500μL和50μL血小板混合，終體積為1.0 mL。將混合物在37℃下溫育20 min，加入2.5 mL Erhlich試劑（2.0 g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于20.0 mL濃鹽酸中，并用蒸餾水補(bǔ)足至100 mL）阻止反應(yīng)。20 min后，在450 nm下讀取吸光度，計(jì)算精氨酸酶活性并表示為mmol·min-1·mg-1蛋白質(zhì)。

2.2.6 檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化將300μL血小板加入試管中，加入300μL 8.1%十二烷基硫酸鈉，500μL乙酸／HCl緩沖液（pH 3.4），500μL 0.6%硫代巴比妥酸，混勻。將混合物在100℃溫育1 h，使用分光光度計(jì)在532 nm下測(cè)量產(chǎn)生的硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)的吸光度，計(jì)算脂質(zhì)過(guò)氧化并表示為mol·g-1蛋白質(zhì)。

2.2.7 NTPD酶和5′-核苷酸酶活性測(cè)定將2 mmol·L-1CaCl250μL、480 mmol·L-1NaCl 50μL、25 mmol·L-1KCl 40μL、240 mmol·L-1葡萄糖50μL、和1 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液10μL混合，pH 8.0，最終體積為200μL。將懸浮在鹽水溶液中的20μL血小板（2～4μg）加入到混合液中，在37℃下孵育10 min，孵育進(jìn)一步持續(xù)70 min，加入終濃度2.0 mmol·L-1底物（ATP或ADP或AMP）開(kāi)始反應(yīng)，并用200μL 10%三氯乙酸（TCA）終止。測(cè)定釋放的無(wú)機(jī)磷酸鹽（Pi），其中孔雀石綠用作比色計(jì)試劑，KH2PO4作標(biāo)準(zhǔn)。添加TCA后添加酶制劑來(lái)進(jìn)行對(duì)照以校正非酶促核苷酸水解。活性表示為釋放的Pi·min-1·mg-1蛋白質(zhì)。

2.2.8 腺苷脫氨酶活性測(cè)定將25μL血小板加入到21 mmol·L-1腺苷中，并在37℃下孵育1 h。分別加入106 mmol·L-1硝普鈉和167.8 mmol·L-1次氯酸鈉溶液終止反應(yīng)。使用硫酸銨作為標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行，ADA活性表示為U·mg-1蛋白。1UE-ADA 定義為釋放每分鐘從腺苷中分離1 mmol氨所需的酶量。

2.2.9 蛋白印跡法檢測(cè)大鼠T細(xì)胞軟骨組織p65和p-IKBα／IKBα蛋白相對(duì)表達(dá)在裂解緩沖液中提取總蛋白質(zhì)，用BCA測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。將10μg蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜，用一抗（p65 1∶500、p-IKBα1∶500、IKBα1∶1 000）在4℃封閉過(guò)夜，加入對(duì)應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，最后進(jìn)行曝光。以β-actin為內(nèi)參，用Quantity One軟件進(jìn)行分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性分析。其中，爪厚度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)用兩因素方差分析，其余均采用單因素方差分析。組間兩兩比較采用LSD-t方法檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α＝0.05（雙側(cè)）。

3 結(jié)果

3.1 苦參堿降低角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠爪厚度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)與正常組相比，模型組大鼠爪厚度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著增加（P＜0.01），說(shuō)明關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建成功；與模型組相比，苦參堿低劑量組大鼠爪厚度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)無(wú)明顯變化，在給藥21天時(shí)苦參堿中劑量組大鼠爪厚度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯減小（P＜0.05），苦參堿高劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)具有更顯著的保護(hù)作用（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠的爪厚度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

3.2 苦參堿降低角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷正常組大鼠軟骨細(xì)胞排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠軟骨細(xì)胞減少，排列紊亂并見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組相比，苦參堿各劑量組大鼠的軟骨細(xì)胞排列紊亂程度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均有不同程度的減輕，苦參堿高劑量組和陽(yáng)性藥物組效果最顯著。見(jiàn)圖2。

圖2 HE染色觀察軟骨損傷程度（×400）

3.3 苦參堿對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠的效應(yīng)／記憶T細(xì)胞應(yīng)答與正常組相比，模型組中IFN-γ+所占百分比增加（P＜0.01），IL-4+所占百分比減少（P＜0.01），Th1／Th2比值明顯增高（P＜0.01）；與模型組相比，苦參堿低劑量組大鼠IFN-γ+和IL-4+所占百分比及Th1／Th2比值無(wú)明顯變化，苦參堿中、高劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠IFN-γ+所占百分比減少（P＜0.05；P＜0.01）（圖3A），IL-4+所占百分比增加（P＜0.05；P＜0.01）（圖3B），Th1／Th2比值降低（P＜0.05；P＜0.01）（圖3C）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定大鼠外周血T細(xì)胞的功能表型

3.4 苦參堿抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)與正常組相比，模型組大鼠血液中IFN-γ、IL-1β、IL-10、TNF-α含量明顯增加（P＜0.01）、IL-4和IL-8含量明顯減少（P＜0.01）；與模型組相比，苦參堿低劑量組大鼠血液中IFN-γ、IL-1β、IL-10、TNF-α、IL-4和IL-8含量無(wú)明顯變化；苦參堿中、高劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠血液中IFN-γ、IL-1β、IL-10、TNF-α含量明顯減少（P＜0.05；P＜0.01），IL-4和IL-8含量明顯增加（P＜0.05；P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 ELISA法測(cè)定大鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-1β、IL-8、IL-10和TNF-α的水平

3.5 苦參堿抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠血小板中精氨酸酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化與正常組相比，模型組大鼠血小板中精氨酸酶活性和TBARS生成量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，苦參堿低劑量組大鼠血小板中精氨酸酶活性和TBARS生成量均無(wú)明顯變化，苦參堿中、高劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠血小板中精氨酸酶活性和TBARS生成量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖5A-B。

3.6 苦參堿對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠ATP／ADP／AMP水解及腺苷脫氨酶活性的影響與正常組相比，模型組大鼠血小板中ATP／ADP／AMP水解均明顯增加（P＜0.01），腺苷脫氨酶活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，苦參堿低劑量組大鼠血小板中ATP／ADP／AMP水解及腺苷脫氨酶活性均無(wú)明顯變化，苦參堿中、高劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠血小板中ATP／ADP／AMP水解明顯減少（P＜0.05；P＜0.01），腺苷脫氨酶活性顯著升高（P＜0.05；P＜0.01）。見(jiàn)圖5C-F。

3.7 苦參堿對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠NF-κB通路激活的影響與正常組相比，模型組p65和p-IKBα／IKBα表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，苦參堿低劑量組大鼠p65和p-IKBα／IKBα表達(dá)均無(wú)明顯變化，苦參堿中、高劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠p65和p-IKBα／IKBα表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05；P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

圖5 各組大鼠血小板中精氨酸酶活性、脂質(zhì)過(guò)氧化、ATP／ADP／AMP水解及腺苷脫氨酶活性

圖6 蛋白印跡法檢測(cè)大鼠T細(xì)胞和軟骨組織p65和p-IKBα／IKBα蛋白表達(dá)

4 討論

RA是以關(guān)節(jié)滑膜變異性炎癥反應(yīng)為主的骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其為自身免疫系統(tǒng)性疾病，免疫機(jī)制復(fù)雜。《黃帝內(nèi)經(jīng)》將類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎歸為“痹”病范疇，認(rèn)為“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”［14］。本研究中成功建立了CIA大鼠模型并評(píng)估苦參堿對(duì)關(guān)節(jié)炎的作用。結(jié)果顯示，苦參堿可降低CIA大鼠的足厚度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)，表明其可能對(duì)CIA有潛在的治療作用。

研究表明，Th1細(xì)胞及其標(biāo)志性細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-1β、IL-8、TNF-α）參與了關(guān)節(jié)發(fā)炎［15］，抑制Th1反應(yīng)是早期RA患者的有效治療方法［16］。Th2細(xì)胞和其分泌的細(xì)胞因子IL-4和IL-10在RA中起保護(hù)作用［17］。在RA中經(jīng)常見(jiàn)到Th1／Th2失衡，Th1／Th2的比例與疾病發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)［18-20］。本研究表明苦參堿顯著降低了CIA大鼠中Th1／Th2比值，說(shuō)明苦參堿通過(guò)調(diào)節(jié)CIA大鼠Th1／Th2免疫失衡抑制炎癥反應(yīng)。

氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化均參與RA的發(fā)病機(jī)制。精氨酸酶活性的增加可能導(dǎo)致一氧化氮合酶與NO解偶聯(lián)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)炎大鼠的血小板精氨酸酶活性增加，與Huang等［22］研究相一致，而苦參堿可顯著降低精氨酸酶活性，可能是由于苦參堿改善關(guān)節(jié)炎狀態(tài)下的NO向血小板的聚集。脂質(zhì)過(guò)氧化是由發(fā)炎組織部位血小板釋放的活性氯／活性氮引發(fā)的［23］，細(xì)胞膜脂質(zhì)降解產(chǎn)生的丙二醛、硫代巴比妥酸活性物質(zhì)（TBARS）等，作為脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)［24］。本研究表明，關(guān)節(jié)炎大鼠產(chǎn)生的TBARS水平增加，苦參堿可顯著降低關(guān)節(jié)炎大鼠中TBARS形成，表明苦參堿具有抑制或延緩關(guān)節(jié)炎大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期RA患者存在血小板計(jì)數(shù)的增高［25］。血小板是血液中嘌呤信號(hào)分子的主要來(lái)源，如ATP、ADP和AMP，這些核苷酸和核苷在免疫和炎癥細(xì)胞調(diào)節(jié)中充當(dāng)信使［26］。腺苷脫氨酶（NTPDase）通過(guò)將腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷來(lái)調(diào)節(jié)腺苷的濃度［27］。炎癥期間，ATP分解后可迅速增強(qiáng)炎癥性關(guān)節(jié)炎的血小板機(jī)能，NTPDase對(duì)ADP的代謝作用可抑制類風(fēng)濕炎癥期間血小板的聚集［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可抑制關(guān)節(jié)炎大鼠ATP／ADP／AMP水解，增加腺苷脫氨酶活性，從而抑制關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥。

NF-κB信號(hào)通路的異常激活通常會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［29-30］。本研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿下調(diào)關(guān)節(jié)炎大鼠p65和p-IKBα／IKBα表達(dá)，表明苦參堿能夠通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路激活調(diào)節(jié)免疫失衡和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，苦參堿能夠減輕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，這可能與苦參堿調(diào)節(jié)Th1／Th2平衡、降低精氨酸酶和腺苷核苷酸水解酶活性、抑制NF-κB途徑的激活有關(guān)，該研究可能為RA的治療提供一種新的治療藥物。