反相高效液相色譜法同時測定利肝寧片中對羥基苯乙酮和綠原酸的含量*

覃芳，李廣勝，郭興輝，胡文文，劉會麗

1.河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州450008；2.河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州450003

利肝寧片，由茵陳、虎杖、黃連、板藍根、白芍、木香、水紅花子、茯苓、砂仁、半夏等中藥組成?？v觀全方，熔清熱解毒、祛濕退黃、養血破瘀、理氣消痞為一爐，標本兼顧，共奏清肝利膽，健脾和胃之功。臨床驗證，對慢性肝炎濕熱中阻證療效顯著。

本方根據張仲景及吳鞠通論“黃疸”和“濕熱中阻”的辨證理論，結合慢性肝炎病程長及臨床表現多變的特點，選用張仲景清肝利膽之茵陳蒿湯和吳鞠通治療濕熱中阻的“辛開苦降”之法而組成本方［1-2］。該方20世紀80年代為湯劑應用于臨床，1990年改為蜜丸，1991年改為片劑后申報為河南省重點科技攻關項目。1993年經河南省衛生廳藥政處與廣西省衛生廳藥政處委托解放軍303醫院臨床觀察，有效率為85.3%。1995年申報鄭州市衛生局批準為醫院制劑使用。該方由湯劑演變成片劑，歷經20余年。制成片劑后，療效確切，服用方便，價格適中，取得了良好的經濟效益和社會效益，深受患者好評。

目前，未見利肝寧片質量控制的相關資料，據文獻報道，對羥基苯乙酮和綠原酸為利肝寧片主藥茵陳藥材利膽藥效的有效成分，明確其含量范圍是控制本藥質量的關鍵?，F參考相關文獻資料，對利肝寧片中指標性成分對羥基苯乙酮和綠原酸的含量測定方法學進行研究［3］。

1 儀器與藥品

1.1 儀器美國Agilent公司1260高效液相色譜儀，chemStation色譜工作站；1310A-IsoPump；G1314A VWD檢測器；上海梅特勒-托利多公司Mettle AE240電子分析天平［4-7］。

1.2 藥品對羥基苯乙酮對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：99.9%，批號：111897-201602）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：96.8%，批號：110753-201817）；利肝寧片（批號：20180501，20180601，20180701）由河南中醫藥大學第三附屬醫院制劑室提供，除乙腈為色譜純外，其余試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×250.0 mm，5μm）；流動相：（體積分數）0.05%磷酸溶液-乙腈（90∶10）；檢測波長：275 nm（對羥基苯乙酮）和327 nm（綠原酸）；柱溫：35 ℃；流 速：1.0 mL· min-1；進 樣 量：20μL［8-16］。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備［17-23］對羥基苯乙酮對照品溶液制備：精密稱取對羥基苯乙酮對照品10.18 mg，轉移至20 mL容量瓶中，加入體積分數70%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻后制成對羥基苯乙酮對照品的儲備液。移液管精密量取對照品的儲備液1 mL，轉移至50 mL容量瓶，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得對羥基苯乙酮對照品溶液，備用。

綠原酸對照品溶液制備：精密稱取綠原酸對照品10.65 mg，轉移至25 mL容量瓶中，加入體積分數70%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻后得綠原酸對照品儲備液；移液管精密量取對照品儲備液1 mL，轉移至10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得綠原酸對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備取利肝寧片20片，精密稱定，置于研缽中研細，精密稱取約4片質量細粉，置于具塞錐形瓶中，并精密量取50 mL體積分數70%甲醇。調整超聲設備功率140 W，頻率42 kHz后進行處理30 min，取出，放冷，再進行質量稱定。用體積分數70%甲醇補足減失的質量，搖勻后離心，并取上清液過濾，取濾液備用。

2.2.3 陰性對照溶液的制備取缺茵陳的陰性樣品10片，按2.2.2供試品溶液制備方法操作，制備陰性對照品溶液。

3 結果

3.1 系統適用性實驗各量取20μL的綠原酸對照品溶液、對羥基苯乙酮對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，分別注入色譜儀，以2.1項下的色譜條件為檢測條件，測定并記錄。在275 nm波長下，供試品溶液中對羥基苯乙酮的保留時間為30.8 min，理論板數按對羥基苯乙酮峰計算7 854，對羥基苯乙酮峰與其他峰分離度符合要求，且在對羥基苯乙酮對照品出峰位置陰性對照品無色譜峰出現。在327 nm波長下，供試品溶液中綠原酸的保留時間為14.7 min，理論板數按綠原酸峰計算9 235，綠原酸峰與其他峰分離度符合要求。在綠原酸對照品保留時間相應的位置上，陰性對照品溶液沒有出現色譜峰。由此可見，在利肝寧片的處方中，其他藥材對羥基苯乙酮和綠原酸的含量測定不產生干擾。見圖1。

3.2 線性關系實驗精密量取對羥基苯乙酮對照品儲備液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL置50 mL容量瓶中，加體積分數70%甲醇稀釋至刻度，分別制成濃度為2.545 mg·L-1、5.09 mg·L-1、10.18 mg·L-1、15.27 mg·L-1、20.36 mg·L-1的標準溶液，按2.1項下色譜條件進樣，每個濃度連續進樣2次，求峰面積平均值。以質量濃度對峰面積作圖，結果經回歸分析得回歸方程：Y＝44.915X+10.007，r＝0.999 7。結果表明，對羥基苯乙酮對照品溶液在2.545～20.360 mg·L-1內與峰面積成良好的線性關系。

精密量取綠原酸對照品儲備液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL置10 mL容量瓶中，加體積分數70%甲醇稀釋至刻度，分別制成濃度為10.31 mg·L-1、20.62 mg·L-1、41.24 mg·L-1、61.86 mg·L-1、82.47 mg·L-1的標準溶液，按2.1項下色譜條件進樣，每個濃度連續進樣2次，求峰面積平均值。以質量濃度對峰面積作圖，結果經回歸分析得回歸方程：Y＝8.803 5X+1.684 8，r＝0.999 8。結果表明，綠原酸對照品溶液在10.31～82.47 mg·L-1內與峰面積成良好的線性關系。

圖1 利肝寧片高效液相色譜圖

3.3 檢出限實驗分別取3.2線性關系實驗項下的溶液，逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣20μL，信噪比S／N為3時，對羥基苯乙酮的檢出限為：20.4 ng；綠原酸的檢出限為：41.2 ng。

3.4 精密度實驗分別精密量取對羥基苯乙酮對照品儲備液0.2 mL和綠原酸對照品儲備液1 mL置同一10 mL容量瓶中，加體積分數70%甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含對羥基苯乙酮10.18μg和綠原酸41.24μg的混合對照品溶液，連續進樣6次，峰面積平均值分別為465.3和360.3，RSD分別為0.9%和1.2%，表明該方法精密度良好。

3.5 穩定性實驗取2.2.2項下供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h測定，對羥基苯乙酮和綠原酸的峰面積均值分別為296.8和285.1，RSD分別為1.1%和1.3%，表明供試品溶液制備后10 h內基本穩定。

3.6 重復性實驗精密稱取樣品6份，樣品批號：20180501。按2.2.2項下的方法制備供試品溶液，并按2.1項下色譜條件測定含量，對羥基苯乙酮和綠原酸的平均含量分別為每片0.08 mg和0.35 mg，RSD分別為1.4%和1.2%，表明該方法重復性良好。

3.7 回收率實驗精密稱取本品（批號：20180501）6份（每份約相當于2片質量），置具塞錐形瓶中，每份精密加入對羥基苯乙酮對照品和綠原酸對照品適量，精密加入體積分數70%甲醇50 mL，稱定質量，按2.2.2項下的方法制備供試品溶液，分別進樣，按外標法計算含量和回收率，結果見表1、表2。

表2 綠原酸回收率實驗結果

3.8 樣品含量測定分別取樣品（批號：20180501，20180601，20180701）細粉適量（約相當于利肝寧片4片質量），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，測定含量，結果每片對羥基苯乙酮含量分別為：0.081 mg、0.080 mg、0.082 mg；綠原酸含量分別為：0.35 mg、0.36 mg、0.35 mg。

4 方法探討

4.1 檢測波長的選擇利肝寧片化學成分復雜，通過供試品溶液全波長紫外圖譜可知對羥基苯乙酮在275 nm波長處有最大吸收，綠原酸在327 nm波長處有最大吸收，為提高被檢測成分的靈敏度和準確度，分別選擇各自的最大吸收波長作為檢測波長，進行兩個波長同時檢測，實現對羥基苯乙酮和綠原酸的同時測定。

4.2 色譜條件的選擇查閱相關文獻，對比篩選磷酸溶液的pH值、濃度和乙腈的比例對分離結果的影響，最終確定（體積分數）0.05%磷酸溶液-乙腈（90∶10）為流動相條件進行實驗分析。同時考察不同品牌型號的色譜柱對分離效果的影響，最終選擇安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，主成分保留時間適中，分離效果好。

4.3 提取方法的選擇近年來中藥浸提新方法、新技術不斷涌現，并被廣泛推廣應用，使中藥制劑的質量不斷提高。如加壓逆流提取法、半仿生提取法、旋流提取法、超臨界流體萃取技術、超聲提取技術、微波萃取技術及高速逆流色譜提取技術等。本實驗參考相關文獻資料，選擇超聲提取法和傳統回流提取法，提取后進行對比發現二者并無顯著差異。超聲提取法的優勢在于，利用超聲波增大物質分子運動頻率和速度的原理，使溶劑穿透力增加，藥物溶出速度和溶出次數得到提高，縮短了提取時間，并且提取所用設備操作簡單，供試品受熱溫度低，被測成分穩定性好，故最后選擇了超聲提取法。另對提取溶劑和提取時間進行考察，采用體積分數50%、70%和100%的甲醇為提取溶劑，分別超聲提取30 min、60 min、120 min，結果體積分數70%的甲醇提取效率最高，超聲時間對含量測定結果基本無影響，故提取方法最終確定為選擇體積分數70%的甲醇為溶劑超聲提取30 min。

5 討論

乙型肝炎病毒（hepatitis b virus，HBV）慢性感染有高度的種屬和組織特異性，HBV慢性感染會導致不可逆的肝細胞炎性壞死和纖維化，最終進展為肝硬化或肝癌。近年來，治療慢性乙型病毒性肝炎領域的一大突破，就是已經認識到只有從根本上抑制HBV的復制才能夠明顯延緩疾病的進展，并據此開發出了很多新型的抗病毒藥物，把病毒復制量控制在比較低的水平，但很多藥物存在耐藥問題，一旦抗病毒藥耐藥將無法繼續控制HBV的復制［24］。目前對HBV的感染尚無有效的徹底治愈手段。

近年來研究顯示，中醫利用其整體辨證論治的核心理念治療慢性乙型病毒性肝炎，標本兼治，不僅改善癥狀，還通過調理機體提升免疫力，延緩疾病進展、改善患者生活質量。中醫治療慢性乙型病毒性肝炎具有其獨特的優勢。

利肝寧片的組方是李學斌教授的經驗方，應用臨床多年，療效顯著。方中茵陳苦、微寒，歸肝、膽、脾、胃經，清熱利濕，為退黃要藥，常用于治療濕瘡瘙癢、黃疸尿少及傳染性黃疸型肝炎。大量文獻報道，綠原酸、咖啡酸和對羥基苯乙酮為茵陳藥材利膽作用的有效成分［25］。

本實驗利用RP-HPLC法測定利肝寧片中對羥基苯乙酮和綠原酸的含量。選用綠原酸和對羥基苯乙酮的最大吸收波長為檢測波長進行雙波長檢測，最大程度減少其他成分對檢測成分的干擾。流動相選擇（體積分數）0.05%磷酸溶液-乙腈（90∶10），在選定的色譜條件下，對羥基苯乙酮和綠原酸的保留時間分別是30.8 min和14.7 min，目標峰與其他峰分離度良好，且在該時間點陰性對照品無其他干擾峰出現。該實驗為利肝寧片的質量控制提供了有效方法，對進一步明確其療效補充了理論依據。