基于網絡藥理學探析獨活治療強直性脊柱炎的作用機制*

王琳玲，孫曉靜，孫治中，雷旭杰，劉曉玲

1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州510405

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是臨床表現出脊柱關節疼痛、活動障礙、強直甚至出現畸形的，主要以侵犯骶髂關節、外周關節及脊柱（如脊柱骨突、脊柱旁軟組織）的自身免疫性疾病［1］。AS典型的病理改變為炎癥、骨質破壞和新骨的形成［2］。全球約0.1%～0.5%的人口受此病困擾［3］，在我國發病率約0.3%，男女的患病比例大約為3∶1，其中以青壯年男性居多［4］。AS目前主要的治療手段是消炎鎮痛、防止骨破壞減少及新骨形成，以達到延緩及控制病情發展的效果。與現代醫學相比，傳統中醫藥在AS的治療中具有獨特的優勢，在辨證的基礎上遣方用藥可有效緩解疾病帶來的臨床癥狀，控制病情進展。獨活是常用治療AS的中藥之一，具有祛風濕、散寒邪、止痹痛之效，目前針對獨活的研究尚局限于獨活寄生湯等方劑的應用，尚無具體的單一藥物報道，其藥理機制還有待進一步挖掘分析。依托生物信息學、多向藥理學、系統生物學，網絡藥理學可通過與之相關的成分、靶點及通路更加系統地、全面地探討中藥及方劑對相關疾病作用機制［5-7］。本研究結合網絡藥理學相關理論，分析預測獨活治療AS的靶點及相關通路，探析獨活治療AS的作用機制。

1 方法

1.1 活性成分獲取將“獨活”為搜索詞，在中藥系統藥理學技術平臺檢索獨活的化學成分，活性成分篩選條件設置為類藥性（Drug-like，DL）≥0.18、生物利用度（bioavailability，OB）≥30%，以此挑選出獨活的活性成分，并獲取其2D結構。

1.2 獨活相關靶點預測在Pubchem搜索選出獨活的活性成分，獲析相應的2D結構。將獲得的2D結構上傳到Swiss Target Prediction數據庫。根據反向分子對接原理結合獨活成分的2D／3D結構預測出獨活的作用靶點。

1.3 AS相關靶點的獲取及與獨活預測靶點的映射在Gene Cards數據庫中搜索“Ankylosing spondylitis（強直性脊柱炎）”，得到AS的相關靶點。將所得到的獨活預測靶點和AS的相關靶點相互映射以此得到獨活治療AS的預測靶點。

1.4 獨活治療AS的蛋白與蛋白相互作用（Proteinprotein interaction，PPI）網絡的構建在String數據庫中，物種設置為“Homo snpiens”，得到的蛋白-蛋白作用關系導進Cytoscape（3.6.0）軟件，獲得背景網絡。結合獨活作用在AS的靶點，構建出獨活治療AS的蛋白與蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網絡圖。

1.5 Hub網絡的提取在Cytoscape軟件中以“節點連接度”的二倍中位數和“節點介度”以及“節點緊密度”的中位數為篩選條件，施行“Network Analyzer-Network Analysis-Analyze Network”，以此構建出Hub網絡。

1.6 GO富集分析與KEGG通路分析在Cytoscape中將上述Hub網絡中的靶標進行GO（基因本體，Gene ontology）富集分析。在DAVID平臺上選出結果，并進行京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析得到通路（顯著富集，P＜0.01）。gene數按照從大到小進行排序，根據文獻報道搜索結果分析，選出獨活治療AS相關性大的信號通路，找到相關的靶標，結合獨活的活性成分，以此建立“獨活的活性成分-強直性脊柱炎靶標-KEGG通路”的相關網絡圖。將gene數排名前20的通路，在OmicShare平臺上繪制通路氣泡圖。

1.7 分子對接在Systems Dock網站上分子對接Degree值排名前5位的預測靶標與獨活的活性成分，根據其與原生配體的結合能力來評估靶標與獨活活性成分的結合能力及其穩定性。

2 結果

2.1 獨活的活性成分活性成分篩選條件為內服類藥性（DL）≥0.18、生物利用度（OB）≥30%，以此篩查出符合篩選條件的活性化合物共9種。見表1。

2.2 構建獨活的預測靶點與活性成分-強直性脊柱炎靶點的網絡在Swiss Target Prediction數據庫中篩選出315個與上述9種符合條件的活性化合物對應的靶點，161個活性成分2D／3D結構相關的作用靶點。將靶點與GeneCards數據庫搜索得到的3 872個AS相關靶點相映射，以此得到獨活可能與AS相關的靶點67個。

將上述結果導入Cytoscape軟件，獲得獨活的活性成分-強直性脊柱炎靶點網絡圖（圖1）。此網絡圖中共包括76個節點，其中包括9個活性成分和67個靶點，145條邊。

2.3 構建PPI網絡將67個可能與強直性脊柱炎相關的獨活作用靶點導入String數據庫，用Cytoscape繪制獨活作用于強直性脊柱炎的PPI網絡（圖2）。此網絡中共包括76個節點，275條邊。

表1 獨活的活性化合物

圖1 獨活活性成分-AS靶點網絡圖

圖2 獨活治療AS的PPI網絡

2.4 Hub網絡的提取及Hub中的靶標在Cytoscape選取度中心性的二倍中位數、接近中心性的中位數以及介度中心性做篩選依據，獲得獨活治療強直性脊柱炎的關鍵靶點，即Hub中的靶標，繪制出Hub網絡（見圖3）。有26個關鍵靶點，分別為淋巴細胞毒素α（Lymphocyte Toxin Alpha，LTA）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、Dickkopf-1蛋白、白細胞介素23R單核苷酸多態性（Interleukin 23R single nucleotide polymorphism，IL-23R SNP）、內質網氨肽酶-1（Endoplasmic reticulum aminopeptidase-1，ERAP1）、內質網氨肽酶-2（Endoplasmic reticulum aminopeptidase-2，ERAP2）、白細胞介素-1R（Interleukin-1R，IL-1R）、微小核糖核酸146a（Microribonucleic acid 146a，miR146a）、微小核糖核酸155（Microribonucleic acid 155，miR-155）、微小核糖核酸175p（Microribonucleic acid 175p，miR-17-5p）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、基質金屬蛋白酶-3（Matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、硬化蛋白、β-連環蛋白（βcatenin）、膠原蛋白家族（Collagen家族）、人類白細胞抗原B27（HLA-B27）、腫瘤壞死因子受體超家族成員11A（Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 11A，TNFRSF11A）、肝／腎／骨型堿性磷酸酶基因（Alkaline phosphatase gene，ALPL）、鈣調蛋白1基因（Calmodulin1，CALM1基因）和鈣調蛋白2基因（Calmodulin2，CALM2基因）、基質金屬蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2，MMP2）、CD4、βⅡ-血影蛋白、CA1（Cornu ammonis 1）。

圖3 獨活治療AS關鍵靶點Hub網絡圖

2.5 GO富集分析用Cytoscape軟件進行GO富集的BP分析（Biological Process），得到6個相關的功能組別（圖4）以及各自所占比例的餅狀圖（圖5）。這6個功能組別為：破骨細胞分化的調控；對抗原刺激的炎癥反應的調節；基于免疫球蛋白超家族結構域構建的免疫受體的體細胞重組，對適應性免疫應答進行正向調控；發熱；細胞因子生物合成過程的調節控制；炎癥反應的正調控。

2.6 KEGG通路分析分析得到97條KEGG通路，進行文獻搜索，選出治療AS的可能通路共12條，得到通路氣泡圖（圖6），包括：免疫相關通路：Toll樣受體信號通路、NF-κB、NOD樣受體、腸道免疫、T細胞受體信號通路；炎癥相關通路有脂肪因子通路、JAK／STAT通路等；骨代謝相關通路有Wnt／β-catenin通路、TNF的通路、破骨細胞分化、類固醇激素的合成等；延緩纖維化相關通路包括：HIF-1α信號通路、HIF-2α信號通路等。

圖4 獨活治療AS可能通路GO富集分析功能組別圖

2.7 “成分-靶標-KEGG通路”網絡圖找到上述獲得的相關通路的靶標，聯合獲得獨活的9種活性成分，作出“獨活的活性成分-AS靶標-KEGG通路”的網絡圖，見圖7。

圖5 GO富集分析功能組別占比餅圖

圖6 獨活治療AS通路氣泡圖

2.8 靶標與活性成分的分子對接將Degree值排名前5位的相關預測靶標與獨活的活性成分在systems Dock網站上進行分子對接。用GraphPad Prism7.0軟件結合Docking Score值制作出熱圖（見圖8），如果值＞4.2，則分子與靶點有一定的結合活性；當值＞5.0，表示有較好結合活性；＞7.0，表示有強烈的結合活性。根據圖8所示，所得值均大于4.2，表明獨活的活性成分與預測靶標的結合具有一定的穩定性。

圖7 “獨活的活性成分-AS靶標-KEGG通路”網絡圖

圖8 預測靶標與獨活活性成分分子對接熱圖

3 討論

《素問·痹論》中對AS描述：“風寒濕三氣雜至……尻以代踵，脊以代頭”，是指AS患病后期脊柱關節屈曲畸形甚至殘疾的臨床特征。AS中醫又稱“腎痹”“大僂”等。獨活具有祛風濕、散寒邪、止痹痛的功效，結合強直性脊柱炎的病因病機，辨證施藥，獨活組方對強直性脊柱炎具有良好的療效。

3.1 獨活治療AS的關鍵靶點預測結果表明，獨活治療AS的關鍵靶點有26個，具體為：LTA、TNF、DKK-1、IL-23R SNP、ERAP1及ERAP2、IL-1R、miR146A、miR-155、miR-17-5p、TLR4、MMP-3、SOST、β-catenin、HLA -B27、Collagen 家 族、TNFRSF11B、ALPL、CALM1基因及CALM2基因、MMP2、CD4、SPTBN1、CA1。

LTs（LTα、LTβ，The Lymphotoxinα／β）和LIGHT（LT相關可誘導配基，LT-related inducible ligand）、TNF共同組成信號網絡調節先天性和獲得性免疫應答［8］。DKK-1蛋白參與韌帶骨贅生成以及全身炎癥反應［9］。IL-23R SNP可能是通過影響細胞使IL-23／Th17免疫軸發生紊亂，導致AS患者產生慢性炎癥和組織受損、骨骼破壞［10］。ERAP1、ERAP2在T細胞介導的強直性脊柱炎中，對T細胞的發育、分化和功能具有重要的作用［11］。IL-1R與免疫、炎癥有關，可促進炎癥慢性化［12］。miR146A導致骨破壞，miR-155可以介導炎癥因子的合成、表達，并且能促使炎癥的產生及加劇［13］。上調miR-17-5p在成纖維細胞中的表達后，促進其骨分化［14］。

研究發現，TLR4在AS患者增厚的血管中層平滑肌細胞中、滑膜組織中均高表達［15］。有研究推測MMP-3發揮蛋白酶裂解的活性，能發揮促炎作用［16］。SOST的產生來源可能是AS發生骨化的初始。SOST的低水平表達與骨贅形成存在相關性［17］。HLA-B27陽性與AS的早發髖關節強直具有強相關性［18］，這可能與致病基因、細菌的免疫反應、自身免疫性CTL克隆有關［19］。有研究證實Collagen家 族、TNFRSF11B、ALPL、CALM1、CALM2、MMP2、MMP3、CD4、SPTBN1、CA1等與關節的炎癥、骨化密切相關［20］。

3.2 獨活治療AS免疫相關通路獨活治療AS免疫相關通路：Toll樣受體信號通路（即Toll-like receptor signaling pathway）、NF-κB（即NF-kappa B signaling pathway）、NOD樣受體信號通路（即NODlike receptor signaling pathway）以及腸道免疫通路（即Intestinal immune network for IgA production）、T細胞受體信號通路（即T cell receptor signaling pathway）等。實驗研究證明，AS患者中高表達的TLR4［21］以及MyD88非依賴炎癥通路［15］可以激活NF-κB的表達，誘導產生腫瘤壞死因子。研究證明，NF-κB調節釋放IL-10等細胞因子，以此調節控制免疫反應［22］。調控NF-κB如P65／P50的異源二聚體［23］，可以降低AS患者的關節炎癥反應。NOD樣受體中的TLR2和TLR4參與AS的發病［24］。有研究發現腸道菌群、自身免疫以及Th17細胞（T helper 17）通過SAA（血清淀粉樣蛋白A，Serum amyloid A）產生相互影響，另外腸道菌群參與B細胞產生分泌IgA漿細胞，可以減少誘發炎癥的信號。研究表明AS疾病過程需要某些菌群誘導炎癥產生［25］。輔助性T細胞表面的PD-1表達的減少與AS的脊柱影像學變化有關［26］。

3.3 獨活治療AS相關通路獨活治療強直性脊柱炎炎癥相關通路有脂肪因子通路（即Adipocytokine signaling pathway）、JAK／STAT通路（即Jak-STAT signaling pathway）等。研究發現脂肪因子通路在風濕免疫病中的抵抗素水平與炎癥相關標志物有關［27］。JAK／STAT通路是強直性脊柱炎患者中重要的炎性通路，其異常的活化導致Th17的分化異常以及IL-17的產生異常，進而引發炎癥［28］。

3.4 獨活治療AS骨代謝相關通路獨活治療強直性脊柱炎骨代謝相關通路有Wnt／β-catenin信號通路、TNF通路、破骨細胞分化（即Osteoclast differentiation）、類固醇激素的合成（即Steroid hormone biosynthesis）等。Wnt／β-catenin通路在維持骨穩態過程中起著關鍵作用［29］。TNF可以通過誘導表達DKK1，作為Wnt信號通路的抑制劑，有效減少新骨形成［30］。在炎癥發生時，成骨基因如Ⅰ型和Ⅱ型膠原、骨連接蛋白、骨唾液蛋白等過度表達，最終導致大量的軟骨和骨基質形成，而Wnt信號通路的抑制因子DKK1和SOST的表達則顯著下降，據此通過提高骨代謝中DKK1和SOST的表達，可以有效改善強直性脊柱炎的骨化形成，為新的治療方案提供思路和依據。“TNF制動假說”認為炎癥和骨形成不相關，可獨立激活炎癥和基質細胞，基質細胞的激活可以使新骨形成，還認為炎癥的抑制甚至可能促進骨形成。而TNF的增加可以使DKK1等因子表達，以此分解骨結構，克服成骨分子的成骨作用［31］。破骨細胞（Osteoclasts）在破壞、丟失骨質中產生作用。此外，AS患者滑膜中的TRAP+（抗酒石酸酸性磷酸酶染色，Tartrate resistant acid phosphatase stain）細胞破壞關節軟骨［32］。研究發現，地塞米松可能與BMP-2及Wnt-β-catenin通路有關，一定濃度的地塞米松可以抑制成骨分化和細胞增殖能力［33］。

3.5 獨活治療AS延緩纖維化相關通路獨活治療AS延緩纖維化相關通路包括：HIF-1α通路（低氧誘導分子-1α通路，HIF-1αsignaling pathway）、HIF-2α通路（低氧誘導分子-2α通路，HIF-2α signaling pathway）等。研究發現炎癥和缺氧是相互依存的，持續的炎癥及免疫反應使氧的消耗增加，導致了局部組織的缺氧。HIF-1α調節血管生成和免疫系統，介導代謝轉變和纖維化，利用該通路精準靶向治療，有望在AS的治療方面獲得新的方法［34］。實驗發現HIF-2α通路可能導致肌腱異位骨化，據此推測，可以通過抑制該通路，可能延緩韌帶纖維化、骨化［35］。

綜上所述，通過網絡藥理學預測獨活可通過多成分作用于SOST、DKK1、TLR4、腫瘤壞死因子、ERAP1、ERAP2等多靶點，在免疫、炎癥、骨代謝、延緩纖維化多方面的相關通路，如Toll樣受體信號通路、NF-κB等多條通路治療AS，但是本研究仍存在很多不足之處，研究結果仍需通過實驗研究進一步證明。本研究可以為未來治療AS尋找新藥物、新通路及精準靶向治療提供思路。