活血榮絡方調節自噬治療阿爾茨海默病的分子機制研究*

陳瑤，楊仁義，傅馨瑩，周德生，宋洋

1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208

阿爾茨海默病（alzheimer disease，AD）是一種以記憶力下降、行為改變及認知功能障礙為主要表現的中樞神經退行性疾病。我國AD患者600萬～800萬，呈上升趨勢，預計2040年將成為世界第一大發病國［1］。AD的防治是當前亟待解決的社會問題，但是其發病機制及藥物治療仍是醫學的重大難題。自噬作為細胞程序性死亡方式之一，能通過清除受損細胞器、錯誤蛋白質，同時回收必要氨基酸等物質調節機體細胞穩態，在神經細胞衰老中發揮重要作用。

中醫將AD歸屬于“癡呆”“神呆”等范疇，病機與五臟虛弱，腦髓生成乏源或腦絡不通，腦髓不純有關，腦氣凝滯皆由氣血不暢所致，腦與臟腑之氣不接，腦中氣血虧虛或不通是癡呆的關鍵病機。筆者根據癡呆病因病機，結合多年臨床經驗認為癡呆病機屬榮氣虛滯范疇。榮氣虛，腦脈失養，生髓乏源；又榮氣滯，痰濁瘀血內生，相互搏結，蒙蔽清竅，腦髓不純，二者消長失衡致神機失用，發為呆病。以“陰虛血瘀-榮氣虛滯”理論立方的活血榮絡方，由雞血藤30 g，黃精15 g，乳香10 g，川芎10 g，石楠藤30 g，生地黃15 g，沒藥10 g組成。活血榮絡方中雞血藤、石楠藤共為君，補血活血以通經活絡；黃精、生地黃共為臣，補血滋陰以補髓填精，調氣機以助雞血藤、石楠藤補血活血，補真陰以滋腦髓空虛；乳香、沒藥共為佐，通經活絡兼以化瘀止血，助雞血藤、石楠藤之活血之功，以暢氣機；川芎為使，味薄而氣芳，升達頭目，透暢巔頂，多竅而質不堅，可貫脈透表，內外肢節，攜諸藥直達病灶。諸藥合用，共奏滋陰活血、通經活絡之功，對癡呆陰虛血瘀證頗為有效。本研究為進一步揭示活血榮絡方治療癡呆的分子機制，采用生物信息學聯合網絡藥理學方法，從分子網絡角度對活血榮絡方進行多成分、多靶點分析，并探討其通過自噬治療AD的分子機制，為活血榮絡方治療AD提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 活血榮絡方有效活性化合物的篩選采用TCMSP［2］（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）數據庫，以OB≥30%，DL≥0.18%，BBB≥-0.3為篩選條件［3］，獲取活血榮絡方君藥雞血藤，臣藥黃精，佐藥乳香，使藥川芎的有效活性化合物。

1.2 活血榮絡方靶點與“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點的獲取通過PubChem［4］（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）與 Chemspider［5］（http：／／www.chemspider.com／）數據庫，獲取活血榮絡方有效活性化合物3D結構式，并導入Swiss Target Prediction［6］（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）數據庫，以獲取活血榮絡方靶點。

通過GeneCards（https：／／www.genecards.org／）數據庫，以“Alzheimer Disease”和“Autophagy”為檢索詞，以Score值≥10為限定條件篩選疾病作用靶點［7］，以獲取AD和自噬的作用靶點。

取“活血榮絡方靶點”“AD靶點”與“自噬靶點”的交集，并通過Bioinformatics（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）實驗室的“韋恩圖”工具，繪制韋恩圖。

1.3 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點PPI網絡構建通過String［8］（https：／／string-db.org／）數據庫，設定最低要求互動分數為中度信度0.400［9］，導入“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點，以獲取蛋白互作（PPI）信息。采用Cytoscape 3.7.2中Network analyzer功能分析PPI信息，計算Degree值及可視化，同時結合WebGestalt［10］軟件計算“隨機游走概率”。

1.4 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO和KEGG富集分析通過WebGestalt［10］（http：／／www.webgestalt.org／＃）數據庫，采用“ORA”算法，導入“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點，獲取GO（BP、CC、MF）和KEGG富集分析數據，進行“加權集合覆蓋”分析，并繪制火山圖。

1.5 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點miRNA預測及網絡分析通過TargetScan［11］（http：／／www.targetscan.org／mamm_31／）數據庫，導入“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點，以獲取其反向預測的miRNA，利用Cytoscape 3.7.2軟件將mRNA-miRNA互作關系可視化。

利用WebGestalt（http：／／www.webgestalt.org／＃）數據庫，導入“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點，進行反向miRNA預測，基本參數設定同1.4項下，進行“Network-miRNA”預測和加權集合覆蓋分析，將兩個數據庫篩選并收集的miRNA整合分析。

2 結果

2.1 活血榮絡方有效活性化合物的篩選采用TCMSP數據庫獲取422個活血榮絡方活性化合物，君藥雞血藤68個；臣藥黃精38個；佐藥乳香127個；使藥川芎189個，篩選后獲得活血榮絡方中雞血藤14個、黃精7個、乳香8個、川芎6個有效活性化合物。見表1。

2.2 活血榮絡方靶點與“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點通過Swiss Target Prediction數據庫對活血榮絡方有效活性化合物靶點進行預測，得到雞血藤303個靶點，黃精240個靶點，乳香171個靶點，川芎314個靶點，去除重復值保留唯一值，獲取567個活血榮絡方靶點。

通過GeneCards數據庫獲取AD靶點，以Score值≥10為限定條件進行初步篩選，共得到286個AD靶點；通過GeneCards數據庫獲取自噬靶點，共得到4 715個自噬靶點。

利用Bioinformatics取交集獲得“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點36個，得到韋恩圖見圖1，共同分子靶點見表2。

表1 活血榮絡方中活性化合物基本信息

2.3 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點PPI網絡構建采用String數據庫及Cytoscape軟件對“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點進行PPI網絡分析，得出PPI網絡圖。設定20≤Degree＜30為紅色；15≤Degree＜20為黃色；10≤Degree＜15為藍色；1≤Degree＜10為粉紅色，Degree值越大，節點越大，見圖2，靶點蛋白隨機游走概率見表3。

圖1 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點韋恩圖

該網絡圖中有36個靶點，包含36個節點，245條邊，平均聚類系數為0.676，其中包括APP（Degree＝29）、CASP3（Degree＝27）、MAPK3（Degree＝23）、TNF（Degree＝22）、MAPK8（Degree＝22）、IL6（Degree＝22）、CASP8（Degree＝21）、PSEN1（Degree＝21）、MAPK1（Degree＝21）等。結果表明，活血榮絡方可能通過多個作用靶點在阿爾茨海默病自噬機制中發揮作用。

圖2 “活血榮絡方-AD-自噬”共同靶點蛋白PPI網絡圖

表2 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點

表3 共同靶點隨機游走概率分析

2.4 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO和KEGG富集分析“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO分析，共富集出10個生物進程（BP），結合“P-Value”值，加權集合覆蓋后獲得5個最相關生物過程，依次為突觸信號轉導的調控、肽絲氨酸修飾、對氧化應激的反應、對細菌起源分子的反應、積極調控蛋白水解。根據“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3-BP。

“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO分析，共富集出29個細胞組分（CC），結合“P-Value”值，加權集合覆蓋后獲得7個最相關細胞組分，依次為膜區、神經細胞體、軸突部分、突觸前、包涵體、去極化增長點、神經脊柱。根據“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3-CC。

“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO分析，共富集出16個分子功能（MF），結合“P-Value”值，加權集合覆蓋后獲得9個最相關分子功能，依次為內肽酶活性、天冬氨酸肽酶活性、半胱氨酸型肽酶活性、蛋白質絲氨酸／蘇氨酸／酪氨酸激酶活性、蛋白質絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、生長因子受體結合、細胞因子受體結合、tau蛋白結合、蛋白質自締合。根據“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3-MF。

“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點KEGG分析，共富集出9 696條信號通路，結合“P-Value”值，依次為老年癡呆癥、細胞凋亡、IL-17信號通路、TNF信號通路、百日咳、非酒精性脂肪肝病、C型凝集素受體信號通路、結核、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、軍團菌病。根據“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖4。

2.5 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點miRNA預測及網絡分析TargetScan數據庫中反向預測出共同靶點782個miRNA-mRNA相互作用，在Cytoscape軟件中將共同靶點的mRNA設置為“三角形”“紅色”；將反向預測的miRNA設置為“圓形”“淡黃色”，可視化如圖5。

圖3 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO富集分析BP、CC、MF火山圖

圖4 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點KEGG富集分析火山圖

圖5 “活血榮絡方-AD-自噬”共同靶點mRNA-miRNA相互作用預測關系

WebGestalt數據庫反向預測miRNA，所有共同靶點mRNA富集在88個miRNA中，加權集合覆蓋分析后得出10個最相關miRNA，得出“Expect”“Ratio”“P-Value”值，具體見表4。

表4 mRNA-miRNA預測及加權集合覆蓋分析后結果

整合兩個數據庫，明確共同靶點miRNA-mRNA最可能預測關系，即miR-302A-GSK3B；miR-513-ACHE／DRD3／NTRK2；miR -193A／miR -193B-PLAU；miR-217-MAPK1；miR-18AMAPT；miR-200A／miR-141-DRD2／PSEN1／TTR；miR-101-DYRK1A／PTGS2；miR-153-SNCA；miR-520G／miR-520H-DYRK1A；miR-506-CAPN1／ERN1／PSEN1。

3 討論

《素問·痹論》云：“榮者，水谷之精氣也，和調于五臟，灑陳于六腑，乃能入于脈也，故循脈上下，貫五臟，絡六腑也。”榮者，滋人體，養神色，主生化也［12］；榮氣者，精微物質之總稱也，屬陰中之陰［13］，“陽化氣，陰化形”，人體形態結構、功能代謝及精神意識皆由榮氣所化生。榮氣為《黃帝內經》中“物質、功能、轉化”之氣［14］，能滋形骸，榮腦髓，其氣化流通得暢，則神機守，神氣顯，陰平陽秘，氣血暢達。故榮氣足則五臟俱榮，化髓有源，神機得守，則腦髓得以用，精神佳，記憶強。榮氣異常表現為榮氣虛、榮氣滯［15］，二者同時共存，相互影響轉化，榮氣虛滯則機體榮養與生發功能障礙。腦為“髓海”“奇恒之腑”，藏腦髓，傳神機，為元神之府，為五臟六腑精、氣、神匯聚之所。榮氣虛滯則腦髓失養，神機失用，五神失職，則靈機退失，發為癡呆，故榮氣虛滯是癡呆的基本病機。活血榮絡法以滋陰活血為主，滋陰基礎上結合臟腑病位聯合補氣、補血、補精等，活血基礎上配伍理氣、化痰、清熱、瀉實等，佐以開竅。

生物信息學是生物醫學與計算機科學的綜合體，利用數學分析方法，已成為系統生命學的重要組成部分［16］。通過分子網絡數據挖掘方法分析DNA、RNA、蛋白質等生物分子以網絡整體調控模式參與機體的生命過程。“辨證論治”“整體觀念”是中醫學基本特色，網絡藥理學、分子網絡數據挖掘等生命信息學從系統整體對藥物、疾病、機制進行科學認識，兩者具有高度契合度。本研究采用生物信息學方法，挖掘活血榮絡方活性成分、篩選分析“活血榮絡方-AD-自噬”共同靶點，從分子、基因角度研究活血榮絡方通過自噬治療AD的作用機制。

本研究采用網絡藥理學方法，得到活血榮絡方有效活性化合物中，雞血藤14個、黃精7個、乳香8個、川芎6個，共預測出567個活血榮絡方靶點，提示活血榮絡方的治療作用與其有效活性化合物整體協同調節567個靶點有關。進一步挖掘“疾病-表型”，即“AD-自噬”的靶點，采用韋恩圖交集分析“活血榮絡方-AD-自噬”共同靶點36個。前期研究結果證實活血榮絡方治療AD主要與上調Wnt5α、Fz5、Ca MKII、AchE、ChAT等靶點有關［17-18］，與本研究網絡藥理學方法挖掘出的靶點有高度重合，提示活血榮絡方可能多靶點調節自噬在治療AD中發揮的作用。

PPI網絡結果表明，“藥物-疾病-表型”共同靶點具有整體復雜的網絡相互作用關系。活血榮絡方主要通過炎癥因子、腫瘤壞死因子、細胞程序性死亡因子等多種分子相互作用調節自噬治療AD。GO、KEGG富集結果表明，活血榮絡方能多靶點、多結構、多形式地參與生物進程，預測得出在膜區、神經細胞體、軸突部分等細胞成分中，活血榮絡方通過AD信號通路、細胞凋亡、IL-17信號通路、TNF信號通路調控內肽酶、天冬氨酸肽酶、半胱氨酸型肽酶等活性，影響突觸信號轉導等生命過程。“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點反向預測miRNA并加權覆蓋集合分析結果表明，多個miRNA參與此過程，整合PPI、GO、KEGG數據，推測活血榮絡方調節自噬治療AD中miRNA-531、miRNA-217、miRNA-200A等靶向結合共同靶點mRNA抑制其翻譯過程。AD主要病理變化是機體β-淀粉前體蛋白β樣蛋白在胞外沉積，從而形成老年斑。APP是跨膜蛋白，能被β-分泌酶、APP切割酶、γ-分泌酶切割形成Aβ，APP／Aβ失衡能使機體內自噬體中Aβ沉積［19］，因此自噬在AD的發生發展中發揮作用。同時研究發現自噬下調會導致APP及γ-分泌酶異常表達，產生毒性Aβ致AD疾病發展［20］。CASP3、CASP8、MAPK3、MAPK8、MAPK1是細胞凋亡通路關鍵分子，TNF、IL6是炎癥相關通路（IL-17信號通路、TNF信號通路）關鍵分子。大量研究發現半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族基因可在AD中過表達，如Ayala-Grosso等［21］采用波譜蛋白共定位法證明CASP3在AD患者大腦中表達上調，且Fricker［22］證實其能進一步促進IL-1、IL-1β、TNFα和NO的產生，導致APP基因裂解的Aβ和tau過度磷酸化，從而誘導老年斑形成和神經元程序性死亡。基于前期團隊研究成果并結合PPI、GO、KEGG富集分析得出，活血榮絡方可能通過多靶點、多途徑、多通路，以網絡化形式影響多種機制，從而調節自噬治療阿爾茨海默病，其中主要通過調控AD信號通路中APP與PSEN1分子表達，并協同調控凋亡和炎癥反應通路相關分子表達，影響自噬途徑治療AD。

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的長度約為22個nt的非編碼RNA，一般認為成熟miRNA 5′端的2～8位核苷酸序列為種子序列，是miRNA與靶基因mRNA特異性結合的區域。在哺乳動物中，miRNA形成后主要通過與目的基因mRNA3′UTR（非翻譯區）形成不完全互補配對，阻斷目的基因表達，從而調控哺乳動物1／3的mRNA表達，參與多種生物學過程，被認為具有極其重要的功能［23］。研究發現miRNA-96能調節mTOR，在血管性癡呆自噬中起關鍵作用［24］；miRNA-214-3p作為新的神經保護因子在AD中能抑制自噬并減輕神經元 凋 亡［25］；Chen等［26］最 新 研 究 發 現 上 調miRNA-34a能介導SIRT1／mTOR信號通路預防阿爾茨海默病，整合TargetScan、WebGestalt數據庫，利用加權集合覆蓋分析，得出miR-302A、miR-513、miR-193是最可能參與活血榮絡方調控自噬治療AD的潛在miRNA。Kong等［27］采用μParafloTMmiRNA微陣列分析得出miRNA-193在果蠅AD模型中異常表達，但是其余miRNA尚未在AD疾病中報道，所以篩選出的miRNA是否在活血榮絡方調控自噬治療AD中發揮作用，需要后期進一步實驗驗證。

綜上所述，活血榮絡方可能調節自噬治療AD，其分子機制主要與活血榮絡方中的β-谷甾醇、芒柄花黃素、豆甾醇等多種有效活性成分，協同調節APP、SNCA、PTGS2等多靶點與多miRNA，通過發揮內肽酶活性、天冬氨酸肽酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等多分子功能，在膜區、神經細胞體、軸突部分等多細胞組分中，參與突觸信號轉導的調控、肽絲氨酸修飾、對氧化應激的反應等多生命進程，激活老年癡呆癥、細胞凋亡、IL-17信號通路等多通路有關，為進一步研究及開發活血榮絡方提供理論依據。