CTCs 與結直腸癌病理特征及術后復發的關系研究

呂焱

目前結直腸癌在世界范圍內的發病率、死亡率分別位居惡性腫瘤的第三位、第二位[1]。近20 多年來，結直腸癌在腫瘤篩查和免疫治療方面取得了很大進步，患者的生存狀況也得到了改善。早期診斷、早期治療可以使結直腸癌患者的10 年生存率提高至93%。但是，對于那些已經發生轉移的晚期患者，治療效果欠佳，10 年生存率仍然低于8%[2-5]。目前，結直腸癌治療仍以手術為主，盡管輔助化療可提高根治性切除術后患者的生存率[6]，但患者復發和轉移的概率仍然徘徊在30%～60%[7]。因此，目前需要一個合適的生物標志物來協助診斷結直腸癌及其評估預后。有研究認為，人體在腫瘤發生發展的過程中，腫瘤細胞會從原發灶脫離出來，而后隨血液循環進入其他部位，其中大部分會被人的免疫系統識別并吞噬，或者自行發生凋亡，但那些少數殘存的會處于休眠狀態，并在血液循環中散播，成為循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）。當微環境合適時，CTCs 就會定植在這些人體組織中，導致腫瘤復發或遠處轉移。CTCs 可以存在于腫瘤發生的各個時期，早期較少，中晚期出現率會增加。CTCs 可以從患者外周靜脈血中檢測出來，這和傳統的活檢相比，這種檢測方法創傷小，可多時間點采樣，有利于觀察患者的病情進展及治療反應，因此又被稱為“液體活檢”[8]。本研究選擇了我院2017 年3 月1 日—2019 年6 月30 日所治療的結直腸癌患者40 例、良性腫瘤對照36 例，檢測外周血中CTCs 數量計算陽性率并分析其與血清CEA、腫瘤組織病理特征、脈管癌栓、術后復發之間的關系，探討CTCs 在結直腸癌預后中的意義。

1 基本資料和方法

1.1 一般資料

本研究收集2017 年3 月1 日—2019 年6 月30 日在我院胃腸外科收治的結直腸癌患者40 例作為研究對象，其中男性26 例，女性14 例，年齡28 ～83 歲；結直腸段良性病變者36 例作為陰性對照，其中女性15 例，男性21 例，年齡46 ～86 歲。所有患者術后病理組織學檢查均依據國際抗癌聯盟（union international cancer control，UICC）第7 版標準進行術后TNM 分期（tumor node metastasis，TNM）。本設計已經通過了我院倫理委員會的批準，且入選的患者及其家屬簽訂了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗對象納入排除標準 結直腸癌組納入標準：（1）患者在手術前均經過內鏡檢查，病理結果和免疫組化結果可以確診為結直腸癌；（2）患者在術前沒有接受過化療、各種抗腫瘤治療及免疫治療；（3）術前充分知情告知，并能遵從醫囑可以定期返院復查；（4）無絕對的手術禁忌癥，可耐受標準結直腸癌根治性切除術；（5）患者術后均按期進行方案化療。

結直腸癌組排除標準：（1）術前沒有被明確診斷為結直腸癌；（2）術前接受過抗腫瘤治療；（3）患者術后的病理結果提示切緣陽性（包括上、下切緣及環周切緣）；（4）患有或曾經患有其他腫瘤性疾病；（5）依從性差，不能按期隨訪；（6）無自主行為能力，不符合相關倫理要求。

對照組納入標準：（1）同期經病理結果可確診為良性病變者（包括慢性炎癥、良性潰瘍等）；（2）年齡、性別與入選的結直腸癌組患者差異無統計學意義；（3）既往沒有任何腫瘤病史。

對照組排除標準：（1）無法確診為良性病變者；（2）有腫瘤病史者。

1.2.2 CTCs 的檢測 采用陰性富集聯合免疫熒光原位雜交法，所有標本檢測均在24 h 內完成。首先用ACD 抗凝管采集外周血6 mL，離心去除血漿后用低滲溶液裂解紅細胞，并用抗CD45 免疫磁珠去除白細胞。獲得的細胞用100 μl 2%多聚甲醛涂片固定在載玻片上，于干燥箱中33℃干燥，待標本徹底干燥后進行CTCs 染色鑒定。將標本進行酒精梯度脫水加入20 μl CD45-AF594 熒光抗體，用10 μl DAPI 復染封片后，在熒光顯微鏡下觀察全片或于2 ～8℃避光保存，為避免FISH 信號及抗體染色熒光減弱對結果造成影響，標本務必在一周內完成檢測。在熒光顯微鏡上反復觀察標本會使熒光淬滅，所以在第一次讀片時儲存細胞圖片。循環腫瘤細胞（CTCs）的識別標準：CD45-：紅色信號為陰性，或者呈現淡淡的標記，與白細胞最明顯的區別是沒圍繞細胞核的鮮明紅色光環；DAPI+：標記細胞核，顯藍色，圓或橢圓形；CEP8+異倍體（非二倍體）：信號在橙色通道下均很清晰。本研究中CTCs 在結直腸段良性病變者中檢出數為0 ～5 個/6 mL，其檢出中位數為0 個/6 mL；結直腸癌患者中檢出數為0 ～16 個/6 mL，其檢出中位數為5 個/6 mL。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）提示：選取最佳臨界值為3個細胞/6 mL 血時（AUC ＝0.802，95%CI；0.633 ～0.971；P＜0.001），此時CTCs 檢測在結直腸癌中的靈敏度為71.4%，特異性為83.3%（圖1）。因此本研究中，CTCs 檢出數≥3 個/6 mL 判斷為CTCs 陽性，＜3 個/6 mL 判斷為CTCs 陰性。

1.2.3 血清CEA 的檢測 使用Beckman Access 免疫分析系統和原裝試劑盒進行雙位點夾心法酶免疫分析測定血清CEA。將待測血清加入反應管，同時加入堿性磷酸酶標記的抗CEA 第一位點的大鼠單抗和與磁性顆粒結合的抗-CEA，反應管被傳送到磁性分離區域進行多次沖洗，去除未和固相結合的其他成分后，加入化學發光底物，反應體系中光量子被光電比色計所檢測，光量子與血清CEA 濃度成正比。根據光量子與標準品CEA 的對應關系，計算出血清中CEA 濃度；0 ～5 ng/mL 判定為CEA 陰性，＞5 ng/mL 為CEA 陽性。

1.2.4 脈管癌栓的檢測 標本做成石蠟切片后經蘇木精-伊紅染色法（HE）染色或特殊彈力纖維染色，顯微鏡下若見到血管或淋巴管內有癌細胞巢團視為陽性；鏡下不能直接判斷為陽性者，須經免疫組化標記CD31、CD34、D2-40，陽性者亦視為脈管癌栓陽性。

1.3 觀察指標

定期對40 例結直腸癌患者和36 例良性病變者進行嚴格的隨訪。術后無瘤生存期為行手術至疾病復發或末次隨訪時間（2020年10 月31 日）。時間以月份為單位統計，詳細記錄患者術后組織病理學資料、隨訪資料。術后1 個月第一次在門診的復診內容包括血常規、血清CEA、腹部彩超、腹部CT、盆腔MRI 和胸部X 線等。術后6 個月進行第二次復查。以后每6 個月返院復查一次。以活檢病理結果和（或）影像學診斷作為結直腸癌患者術后復發的判斷標準。

1.4 統計學分析

統計分析均用SPSS 22.0 統計軟件完成，各組間計數資料比較采用χ2檢驗進行，計量資料采用t檢驗，用ROC 曲線分析CTCs診斷的特異性和敏感性。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌患者中陽性率高于良性病變組

在入組的40 例結直腸癌患者中，術前CTCs 陽性率是62.5%，在良性腫瘤組中，陽性率是5.6%，兩組差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 結直腸癌及良性結直腸腫瘤患者CTCs 與病理特征的關系

結直腸癌組CTCs 陽性率高于良性腫瘤對照組，結腸癌患者CTCs 陽性率在不同性別、年齡組（小于與大于等于61 周歲）間差異無統計學意義。結直腸癌患者CTCs 陽性率與腫瘤發生部位及淋巴結轉移有關；結腸癌高于直腸癌，發生淋巴結轉移的結直腸癌患者CTCs 陽性率增高。但是，CTCs 陽性率與腫瘤的分化程度、T 分期（浸潤深度、腫瘤大小）等無相關（表2）。

2.3 結直腸癌及良性結直腸腫瘤患者CTCs 與血清CEA 的關系

結直腸癌患者組與對照組中的CEA 陽性率分別為32.5%和5.6%，P=0.004，差異具有統計學差異。以CEA 陽性、陰性將結直腸癌患者組分為兩組，CTCs 陽性率差異無統計學意義（表3）。將CTCs 檢出水平與CEA 檢出水平做對比，分別檢測出對照組及實驗組的患者術前CTCs 及CEA 結果，并作出各自的ROC 曲線，CEA 的AUC=0.628（95%CI0.436 ～0.820，P＜0.001）， 低 于CTCs 的AUC（0.802），顯示CTCs 在對結直腸癌診斷預測價值優于CEA。CEA 對結直腸癌診斷的特異性較高，但敏感性較差，不是結直腸早期診斷的最佳選擇。CTCs 具有較高的敏感性和特異性，可作為結直腸癌早期診斷的標志物（圖2）。

2.4 術前CTCs 計數與結直腸癌術后復發時間的關系

對40 例患者進行術后監測，平均每2 ～3 個月進行一次病史、體格檢查以及實驗室檢查，每半年進行一次CT 掃描，每年進行一次胸片和結腸鏡檢查。同時對患者自采血之日起進行門診、電話等方式隨訪，隨訪終點是疾病進展或復發及轉移，以判定無進展生存時間（PFS）。PFS 定義為采血檢測CTCs 至化療期間或化療后病情進展的時間。隨訪截止日期為2020 年10 月31 日，40 例入組患者無失訪者。

隨訪期截止時，肝轉移患者有22 例，無肝轉移患者18 例。肝轉移患者CTCs 陽性率高于無肝轉移患者（81.8%vs.38.9%，P＜0.05）。根據隨訪資料，將本研究中的患者樣本分為CTCs 計數陰性組（CTCs ＜3 個/5 mL）和CTCs 陽性組（CTCs ≥3 個/5 mL），進行Kaplan-Meier 生存率分析，結果顯示CTCs 陽性患者的PFS 低于CTCs 陰性的患者，兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 結直腸癌患者術前CTCs 與脈管癌栓的關系

對40 例患者的病理報告進行整理統計后發現，如表5 所見，術前CTCs 陽性的結直腸癌患者術后脈管癌栓陽性者高于術前CTCs 陰性者，同樣，術前CTCs 陰性的患者術后脈管癌栓陰性率高于CTCs 陽性者。兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 結直腸癌與良性腫瘤患者CTCs 陽性率[例（%）]

表2 CTC 陽性率與臨床病理特征的相關性

表3 CEA 陽性及陰性結直腸癌患者CTCs 陽性率[例（%）]

表4 術前CTCs 陽性及陰性結直腸癌患者的肝轉移數量[例（%）]

表5 術前CTCs 陽性及陰性結直腸癌患者脈管癌栓情況[例（%）]

圖1 結直腸癌患者循環腫瘤細胞ROC 曲線

圖2 受試者術前ROC 曲線

3 討論

隨著醫學的發展，有專家指出對早中期結直腸癌患者的早期發現、早期治療可以降低腫瘤轉移和復發率，也能夠避免很多不必要的治療手段，避免給患者帶來較大的副作用，因此目前精準管理結直腸癌的治療尤為重要。循環腫瘤細胞（CTCs）的概念是Ashworth 在1869 年首次提出的[9]，是從患者腫瘤病理組織轉移到血液中的細胞，可以表現出腫瘤細胞的遺傳和表觀特征。目前，隨著CTCs 檢測技術的不斷更新，靈敏度、特異性較以往均有大幅度的提升，已經能夠成為腫瘤的非創性診斷工具，協助臨床對腫瘤進行診斷和預后。

有研究表明，對于消化系統惡性腫瘤的患者，血清中的CTCs可以通過細胞黏附分子附著于血管內皮上，這個新發現為癌癥轉移的生物學機制奠定了基礎[10]，而且這一研究已通過小鼠模型的臨床前研究得到了證實[11]。本研究采用的是免疫熒光原位雜交技術（iFISH），是將免疫熒光染色方法與原位雜交方法相整合，使用CK、CD45、DAPI 分析細胞表面蛋白表型并結合CEP-8 檢測染色體核型來共同識別CTCs。與其他單純的免疫熒光染色方法或者單純染色體的原位雜交方法相比，檢出率更高，可以更好的反映患者體內CTCs 水平。

本研究顯示，結直腸癌患者術前CTCs 陽性率為62.5%，而術前CEA 陽性率為32.5%，所以，在結直腸癌的早期診斷上，CTCs比CEA 具有更高的敏感性和特異性。由于發生淋巴結轉移的結直腸癌患者CTCs 陽性率增高，而且結腸癌高于直腸癌，提示結腸癌患者更易發生轉移。有研究認為，CTCs 檢出率是結直腸癌轉移及預后的獨立危險因素，CTCs 陽性患者外周血中循環腫瘤細胞與患者發生遠處轉移具有相關性[12]。這與我們的研究結果，肝轉移患者的CTCs 陽性率高于未見肝轉移患者基本一致。

另外，研究中還發現，術前CTCs 陽性的結直腸癌患者，術后病理組織中更易發現脈管癌栓，脈管癌栓是癌細胞局部浸潤、淋巴結轉移及遠處轉移時可能會留下的痕跡，是腫瘤轉移過程中的一個重要步驟，因此它是評估患者生存期的一個可靠指標。術前CTCs 陽性可提示結直腸癌患者存在脈管癌栓可能性較高，可提高對術前判斷有無脈管侵犯的準確性，對結直腸癌的術前輔助治療提供依據。

綜上所述，CTCs 具有預測結直腸癌患者復發或轉移的評估效能，有望成為結直腸癌篩查與診斷的有效指標，為臨床上更早地發現結直腸癌的復發或轉移提供了重要的評價依據。