轉移性結直腸癌患者ctDNA基因突變檢測方法的比較及影響因素分析

陳馨寧，黃 斐，沈敏娜，楊軼慧，王蓓麗,2，郭 瑋,2

1.復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032 2.復旦大學附屬中山醫院廈門醫院檢驗科，福建 廈門 361015

循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是腫瘤細胞體細胞DNA經脫落或當細胞凋亡后釋放進入循環系統，存在于血液、尿液、腦脊液等體液中。ctDNA分析能夠快速甄別細胞信號通路上的基因突變情況并且能夠定量ctDNA的突變豐度［1-3］。

常規基因測序技術如Sanger測序、焦磷酸測序只能檢測出高負荷腫瘤或ctDNA含量較高的患者體內的腫瘤突變片段。隨著DNA測序技術的快速發展，已實現對痕量DNA分子進行定量分析。常見的ctDNA檢測技術有二代測序（next generation sequencing，NGS）、微滴式數字聚合酶鏈反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、MALDI-TOF等。

本文建立了NGS和MALDI-TOF兩個分析平臺，檢測轉移性結直腸癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）患者血漿ctDNA中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因的常見突變；分析兩個平臺在檢測血漿ctDNA突變中的性能及血漿ctDNA在指導臨床診療方面的潛在價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2016年6月—2017年1月復旦大學附屬中山醫院收治的30例mCRC患者。

1.2 入選標準

患者均經活組織病理學檢查確診為結直腸腺癌，臨床分期為Ⅳ期（即轉移性癌）且均有3處及以上轉移灶，所有患者的活檢組織都接受過分子診斷，明確了KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因的突變狀態。每例患者收集2管10 mL乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝全血，明確采血時間和采血時的患者狀態。

1.3 方法

1.3.1 標本預處理

抽取10 mL外周血全血（EDTA抗凝管）。采用兩步離心法，1 600×g，4 ℃離心10 min后吸取離心后的血漿，16 000×g，4 ℃再次離心10 min，吸取上清，-80 ℃凍存備用。使用QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit（德國Qiagen公司）抽提ctDNA。ctDNA定量使用Qubit dsDNA HS Assay Kit核酸定量分析試劑盒（美國Invitrogen公司），由ctDNA-Qubit 3.0得到具體濃度后用高靈敏度DNA分析試劑盒（5067-4678）在Agilent 2100 Bioanaylzer上進行樣本質量控制。剩余標本-20 ℃保存。

1.3.2 病史獲取

通過病史查詢的方式獲取由復旦大學附屬中山醫院病理科為患者組織標本進行的分子病理學檢查結果和復旦大學附屬中山醫院檢驗科為患者血液進行的癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）檢測結果。

1.3.3 ctDNA-NGS檢測

采用美國Illumina公司NGS平臺MiSeq，配合上海安可濟生物科技有限公司的Comet結直腸癌試劑盒（AccuraGen Accu-Kit）完成對上述標本的檢測。最終測序的結果中將包含所檢測的基因、外顯子、堿基和對應氨基酸的改變方式，并附上每種基因突變的拷貝數及豐度作為定量結果，突變豐度的計算公式如下：突變豐度=（突變型拷貝數）/（突變型拷貝數+野生型拷貝數）×100%。

1.3.4 ctDNA-MALDI-TOF檢測

使用美國Agena公司UltraSEEKTM Colon Panel試劑盒進行MALDI-TOF檢測。出具的結果由軟件進行自動分析和處理，最后進行對靶目標序列的定性和半定量分析。

1.3.5 ctDNA-ddPCR檢測

使用QX100 ddPCR?系統完成對上述標本的檢測。QX100系統包括QX100微滴生成儀和QX100微滴分析儀，另配備美國Bio-Rad公司的96深孔反應模塊PCR儀。檢測試劑盒選用美國Bio-Rad公司的商品化試劑盒（貨號：Lot1863110～1863115及Lot1863102），包括突變位點KRASG12A、KRASG12C、KRASG12D、KRASG12R、KRASG12S、KRASG12V、BRAFV600R。系統將計算陽性和陰性微滴的數量，從而以數字格式對靶DNA進行絕對定量分析。

1.4 統計學處理

采用SPSS 11.0統計軟件分析數據，采用配對資料t檢驗進行分析。以總符合率、陽性預測值和陰性預測值作為評判兩個平臺的主要參數指標，計算公式：總符合率=［（真陽性+真陰性）/總樣本數］×100%；陽性預測值=［真陽性/（真陽性+假陽性）］×100%；陰性預測值=［真陰性/（真陰性+假陰性）］×100%。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入組患者的基本信息

本研究共入組30例CRC患者（表1），其中21例男性，9例女性，平均年齡為59.63歲。30例患者根據TNM分期均處于結直腸癌Ⅳ期，即mCRC且所有患者均進行過腫瘤組織（原發灶/轉移灶）KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因突變檢測并獲得了檢測結果。血清中位CEA水平為46.65 ng/mL（2.90～710.60 ng/mL），血清中位CA19-9水平為37.50 ng/mL（8.40～7 506.00 ng/mL），血清中位CA125水平為17.05 ng/mL（4.80～1 141.00 ng/mL）。

2.2 患者組織和血漿中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因突變的情況

本研究比較了30 例患者組織和血漿中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因突變的情況（圖1）。ADx-ARMS中獲得的組織結果同通過NGS獲得的血漿ctDNA結果比較，22例患者組織和血漿結果完全匹配；但由于組織和血漿采樣時間不同以及期間接受治療，有8例患者出現了組織和血漿結果不匹配的情況。ADx-ARMS中獲得的組織結果同通過MALDI-TOF獲得的血漿ctDNA結果比較，18例患者組織和血漿結果完全匹配；同理，有12例患者出現了組織和血漿結果不匹配的情況。

根據以上結果可見，NGS與組織結果匹配度較高（73.3%），但由于患者組織標本和患者血漿標本獲取的最長時間間隔達3年6個月，最短時間間隔為6 d，盡管組織ARMS結果存在一定參考價值，但該匹配度可能與臨床實際情況不符。因此，本研究查閱病史，結合患者的治療、手術情況，并且引入ddPCR對突變位點進行復核（表2）。

表1 患者基本信息Tab.1 Patient characteristics［n (%)］

圖1 組織結果與血漿ctDNA結果匹配情況Fig.1 Correlation between ctDNA results and tumor ARMS results

2.3 MALDI-TOF和NGS的符合率、陽性預測值及陰性預測值

MALDI-TOF和NGS的符合率分別為76.67%和86.67%，陽性預測值為86.67%和83.33%，陰性預測值為66.67%和91.67%（表3）。

2.4 提取的ctDNA的量與原發灶切除與否的關系

從患者血漿中提取的ctDNA的量與原發灶切除與否無相關性（P=0.724 7）；突變位點豐度與原發灶切除與否顯著相關（P=0.001，圖2）。

表2 采用ddPCR復核數據Tab.2 Data of re-detection using ddPCR

表3 MALDI-TOF和NGS的符合率、陽性預測值及陰性預測值Tab.3 The coincidence rate,positive predictive value and negative predictive value of MALDI-TOF and NGS

圖2 原發灶切除與否與患者突變位點豐度及ctDNA的量的關系Fig.2 Correlation between primary tumor resection and the abundance of mutation sites/the amount of ctDNA

2.5 提取的ctDNA的量與患者接受治療與否的關系

從患者血漿中提取的ctDNA的量與患者接受治療（化療、放療、靶向治療）與否無相關性（P=0.871 9）；突變位點豐度與患者接受治療（化療、放療、靶向治療）與否顯著相關（P=0.000 6，圖3）。

組織活檢后血漿采集前使用愛必妥治療的患者6例，其中組織結果為野生型，血漿結果為突變型有4例，占66.7%。2例為BRAFV600E突變，1例為KRASQ61L突變，1例為NRASQ61K突變。

本實驗還統計了不同突變位點及其突變位點豐度分布（圖4），剔除突變發生較少的PIK3CA和BRAF位點。

圖3 是否接受治療與患者突變位點豐度及ctDNA的量的關系Fig.3 Correlation between treatment and the abundance of mutation sites/the amount of ctDNA

圖4 各突變位點豐度情況Fig.4 The abundance of each mutation site

3 討 論

本研究納入了30例mCRC患者，利用NGS和MALDI-TOF檢測入組患者血漿ctDNA中常見突變的性能比對。NGS使用邊合成邊測序的方法對ctDNA進行檢測［4-5］。MALDI-TOF利用質譜分析對PCR衍生的擴增子進行分析［6］。

本研究發現NGS的符合率和陰性預測值較好，而MALDI-TOF的陽性預測值較好。在一項利用NGS檢測108例mCRC患者ctDNA中KRAS、BRAF、BRAS突變狀態代替組織檢測的可行性實驗［7］中發現，血液、組織KRAS突變檢測整體一致性為65.26%，BRAF突變檢測整體一致性為93.68%，NRAS突變檢測整體一致性為96.84%。本研究或需納入更多的病例來判斷NGS在結直腸癌ctDNA突變檢測中的可行性及其他性能。血液樣本檢測結果在肺癌中可以指導臨床用藥已經獲得證實。在一項利用MALDI-TOF檢測結直腸癌腫瘤組織的石蠟包埋標本中KRAS基因突變情況的實驗［8］中，MALDI-TOF較常規測序檢測的檢出率和陽性預測值更高，具有一定臨床價值。仍未見以上兩種方法的陽性預測值、陰性預測值等在結直腸癌ctDNA突變檢測表現方面的大樣本量數據。

組織ARMS雖然是ctDNA-NGS臨床驗證的有效參考方法，但仍有相當比例樣品存在兩種方法結果不一致的情況。本研究引入了ddPCR，作為有效的補充檢測手段，協助分析組織和血檢結果不一致的情況。同時，樣品臨床信息也有助于分析組織和血檢結果不一致的原因。在應用西妥昔單抗之前，臨床上需要進行常規的腫瘤組織RAS基因狀態檢測。本實驗中，6例獲得組織標本前未使用西妥昔單抗，而采血前使用西妥昔單抗的患者中，有4例患者出現了基因突變。2例為BRAFV600E突變，1例為KRASQ61L突變，1例為NRASQ61K突變。其中發生RAS基因突變是患者對西妥昔單抗的耐藥標志［9］。而產生BRAF基因突變一般被認作是不良預后的因素之一［10-13］。鑒于本實驗樣本量較少且研究時間較短，無法確定由野生型轉為突變型的患者的預后情況，以及突變位點是否會對患者后續治療產生影響。

本實驗中ctDNA的量與患者是否接受腫瘤原發灶的切除以及是否接受治療（包括化療、放療、靶向治療）無關。但Tie等［14］報道，化療過程中mCRC患者的ctDNA發生了變化，在治療第2個周期之前就觀察到的48例ctDNA和組織伴有突變的樣本中有41例ctDNA水平顯著降低。推測本研究的樣本量或實驗設計可能產生一定影響，本研究樣本量較少，并且在實驗設計時增加了對同一患者治療前后的血漿ctDNA含量的比較。

在12例KRAS突變和2例NRAS突變患者中，發現RASctDNA突變位點豐度低于1%的患者的腫瘤原發灶均發生在左半結腸；與此同時RASctDNA突變位點豐度高于25%的患者的腫瘤原發灶均發生在右半結腸，結直腸癌中，腫瘤原發灶位于左半結腸通常認為比位于右半結腸預后更好，但仍需對患者進行隨訪，了解其腫瘤進展情況和生存期來驗證以上假設。另外，Morelli等［15］研究發現，基線高的RASctDNA突變位點豐度與生存率低相關。本研究發現，ctDNA突變位點豐度水平與患者是否接受腫瘤原發灶的切除以及是否接受治療（包括化療、放療、靶向治療）有關。接受手術干預和治療的患者的突變位點豐度普遍較低。ctDNA水平和ctDNA突變位點豐度可以在治療開始前為RAS基因突變的患者提供評估信息。

本研究存在部分缺陷，目前來看急需更大樣本量及更長隨訪周期來觀察來自不同平臺ctDNA的數據對于臨床應用的價值。此外，應用ARMS方法獲得的組織分子分型結果的說服力較低，在有條件的情況下使用大基因檢測組合的NGS進行組織分型，將有利于平臺比對以及后續研究的開展。

綜上所述，兩個平臺均可用于檢測mCRC患者ctDNA中的常見突變，但NGS的陰性預測值要優于MALDI-TOF。患者突變位點豐度與患者的原發灶是否手術切除以及患者是否接受過治療（包括化療、放療、靶向治療）有關。