參芪復方浸膏UHPLC指紋圖譜研究

張傳維，畢祿莎，高 泓，謝春光，富曉旭，劉書瑤，鐘卓伶，徐小平

(1.四川大學華西藥學院，四川 成都 610041; 2.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610072)

0 引 言

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一種代謝性慢性疾病，是排名前三的重大疾病之一，針對糖尿病治療的研究越來越受到關注[1]。不同于化學藥是單一組分和明確的單一靶點，中藥復方從機體系統出發，具有多靶點協同作用與毒性分散效應的特點[2]，對2型糖尿病的治療效果更為明顯[3]，已經成為研究熱點之一。參芪復方浸膏是由成都中醫藥大學謝春光教授治療糖尿病多年經驗總結而來的經驗方，它由人參、黃芪、山藥、丹參、大黃等八味藥材制成，在糖尿病治療中已被證實具有輔助控制血糖、改善胰島素抵抗、減少糖尿病并發癥的作用[4-5]。但該復方涉及藥材眾多，容易受多種因素影響，目前尚未建立相關質量控制的方法。

中藥成分繁雜，質量控制方法更為苛刻[6]。同時中藥質量受到藥材產地、品系、季節、炮制工藝等多種因素的影響，質量標準的不完善成為中藥亟待解決的瓶頸，嚴重制約著中醫藥研究和臨床應用的發展[7]。近年來，指紋圖譜技術的引入為中藥的質量控制提供了新的思路。將中藥成分通過綜合的、可量化的特征圖展現，并利用中藥相似度評價軟件獲得中藥所含成分的相近性，可以充分表達中藥整體信息，實現中藥復方的整體質量控制與評價。為此，本研究擬采用超高效液相色譜對參芪復方浸膏進行分離分析，獲得其指紋圖譜，并通過中藥相似度評價軟件完成不同藥材產地對質量影響的考察，為建立全面、可靠的參芪復方浸膏質量控制體系提供依據。

1 材料和方法

1.1 儀器

島津LC-2010A超高效液相色譜儀（島津（中國）分析儀器有限公司）；U3000 UHPLC+Q-Exactive高分辨質譜（賽默飛世爾公司）；HC-500A型華晨高速多功能粉碎機（浙江省永康市金穗機械制造廠）；MP3002J萬分之一電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（成都市予華偉業儀器有限公司）；XW-80A螺旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）；DL-1電子萬用電爐（北京市永光明醫療儀器有限公司）；RE-52系列螺旋蒸發器（上海雅榮生化設備儀器有限公司）；80-2臺式低速離心機（上海手術器械廠）；BT 125D十萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.2 試劑

甲酸AR（天津市津東天正精細化學試劑廠）；乙腈（HPLC，天津科密歐化學試劑有限公司）；甲醇（HPLC，天津科密歐化學試劑有限公司）；乙醇（分析純，成都高新區石羊化學制劑廠）；用于浸膏制備和標準品溶液配制的水為純凈水；用于流動相配制的水為超純水。

1.3 材料

復方由不同產地人參、生地黃、山藥、天花粉、黃芪等8味藥材組成，均來自成都市藥材市場，藥材產地及批號見表1。參芪復方浸膏由實驗室自制，共制備11批（S1-S11）。

表1 藥材產地與批號

對照品（R）：人參皂苷 Re9（R1）、人參皂苷Rb1（R2）、人參皂苷 Rg1（R3）、芒柄花黃素（R4）、隱丹參酮（R5）、大黃素（R6）、尿囊素（R7）、類葉升麻苷（R8）、大黃酸（R9）、毛蕊異黃酮苷（R10）、丹參酮ⅡA（R11）、原兒茶醛（R12）、馬錢苷（R13）、大黃酚（R14）、梓醇（R15）、丹酚酸 B（R16）、蘆薈大黃素（R17）、大黃素甲醚（R18）、丹參酮Ⅰ（R19）、丹參素（R20）、莫諾苷（R21）對照品均來自于上海摩楷生物科技有限公司。

1.4 參芪復方浸膏的制備

將人參、黃芪、天花粉、山藥、生地黃等粉碎成粗粉，取人參粗粉15 g，精密稱定，以30%乙醇150 mL浸漬24 h后，濾過，分別收集濾液和濾渣。將濾液加熱濃縮成稠膏備用。然后，分別稱取黃芪、天花粉、山藥、生地黃等粗粉 15，10，10，10，10，10，6 g與人參浸漬后的濾渣混合，加水750 mL，煎煮兩次，每次 40 min，經離心（4 000 r/min）10 min，過濾，合并濾液。濾液與人參浸膏合并，進一步濃縮為稠膏（每毫升浸膏含有1.72 g生藥）。

1.5 供試品溶液的制備

取參芪復方浸膏1 g，精密稱定。置25 mL量瓶中，分別加甲醇和水各10 mL溶解，超聲20 min，用甲醇定容至刻度。取10 mL于4 000 r/min離心20 min，上清液蒸干，殘渣加50%乙腈2 mL復溶，過濾后（0.45 μm），即得供試品溶液。

1.6 混合對照品溶液的制備

取各對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇制備成混合對照品溶液作為儲備液結果見表2。

表2 混合對照品濃度一覽表 μg/mL

1.7 色譜條件

Opalshell C18色譜柱（100 mm×4.6mm，2.6 μm）；流動相為A相：0.1%甲酸乙腈溶液，B相：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫條件（表3）；檢測波長254 nm；流量：0.3 mL/min；進樣量 20 μL。

表3 HPLC梯度洗脫條件

1.8 質譜條件

掃描質量范圍 (m/z)：70～1 050；分辨率：70 000；鞘氣流量：35 mL/min；輔助氣流量：15 mL/min；毛細管電壓：3.5 kV；毛細管溫度：350 ℃；輔助氣加熱溫度：350 ℃。

2 結果和分析

2.1 方法學驗證

2.1.1 精密度考察

取參芪復方浸膏1 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，按照1.5所述方法制備供試品溶液，按照1.7色譜條件進行分析，供試品溶液連續進樣6次，獲得色譜圖，對各共有峰的保留時間、峰面積、拖尾因子和分離度分別計算其RSD。各共有峰相對保留時間RSD介于0.02%～0.16%，峰面積RSD介于0.34%～2.45%，表現出較好的精密度。

2.1.2 重復性考察

取參芪復方浸膏1 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，按1.5方法制備供試品溶液，平行實驗6次，按1.7色譜條件進行分析，供試品溶液連續進樣6次，獲得色譜圖，對各共有峰的保留時間、峰面積、拖尾因子和分離度分別計算其RSD。各共有峰相對保留時間RSD介于0.03%～0.16%，峰面積RSD介于1.26%～2.26%，表現出具有較好的重復性。

2.1.3 穩定性考察

取參芪復方浸膏1 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，按1.5方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，8，l6，24 h時，按 1.7色譜條件進行UHPLC分析，供試品溶液連續進樣6次，獲得色譜圖，對各共有峰的保留時間、峰面積、拖尾因子和分離度分別計算其RSD。各共有峰相對保留時間RSD介于0.02%～0.24%，峰面積RSD介于0.94%～1.77%，說明供試品在24 h內穩定性良好。

2.2 特征峰定性分析

2.2.1 LC/MS/MS鑒定

通過UHPLC+Q-Exactive高分辨質譜對色譜峰的成分進行鑒定。采用正離子與負離子檢測模式進行檢測，獲得總離子流色譜。樣品在負離子檢測模式下各組分響應情況更好，如圖1所示，部分在負離子模式下無響應的組分通過正離子模式進行檢測。通過比較對照品的保留時間，查閱相關文獻分析各峰組分的裂解途徑[8-15]，初步推斷20個峰所對應化合物的名稱和結構。

圖1 負離子檢測模式下參芪復方浸膏供試品色譜總離子流

以保留時間（tR）為24.53 min的5號峰組分為例，該組分主要以[M+Na]+準分子離子形式存在，m/z為413.140 2，裂解為5種碎片，m/z 413的離子丟失一分子水（18Da）形成m/z 395的碎片離子，丟失一分子甲醇（32Da）生成m/z 381離子，丟失一分子水和一分子甲醇（50Da）生成m/z 363的碎片離子，母核發生裂解，丟失中性碎片C6H8O3生成m/z為285的離子，丟失一分子甲醇與一分子末端葡萄糖殘基生成m/z為219的離子，殘留m/z 185葡萄糖殘基[M+Na]+碎片離子。比較質譜圖與有關文獻記錄可以推斷5號峰為馬錢苷（390.38，C17H26O10）。其他共有峰以相同方式進行鑒定如表4所示。

表4 準分子離子、碎片離子信息與成分鑒定

2.2.2 混合對照品鑒定

按照1.6方法配制混合對照品溶液，混合標準品溶液各組分色譜參數如表5所示。通過將參芪復方浸膏樣品色譜圖與混合對照品色譜圖進行比對，混合對照品色譜圖中20個共有峰對應組分與LC/MS/MS鑒定結果一致，如圖2所示。

表5 混合標準品溶液各組分色譜參數表

圖2 混合對照品色譜圖

2.3 基于指紋圖譜的質量評價

2.3.1 相似度分析

取不同產地藥材，按照1.4方法制備成批號為S1-S11的11批參芪復方浸膏，按照1.5方法制備供試品，通過高效液相色譜獲得11批色譜圖，將色譜圖導入“國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版軟件”設置樣品參考譜，采用平均數法生成對照指紋圖譜，以S1為參考圖譜，標定21個峰作為考察相似度的共有峰，并生成對照圖譜R（圖3）。計算11批參芪復方浸膏與指紋圖譜共有峰之間的相似度，結果表明11批參芪復方浸膏指紋圖譜相似度在0.721～0.972之間，其中S1與S2稍低，S5與 S6相近，S3與 S4相近，S7、S8與S9相似，S10與S11相似。表明不同批次供試品溶液所含化學成分基本一致，但不同批次間各峰的峰面積有一定差異，表明不同產地的藥材對參芪浸膏樣品的各成分的含量有一定的影響。

圖3 參芪復方浸膏的指紋圖譜

2.3.2 聚類分析

采用SPSS 22.0對11批次參芪復方浸膏指紋圖譜的21個共有峰相對面積進行聚類分析，對樣品集合通過數量化方式進行分類，從而用數量化定義樣品之間的相似程度。采用Ward聯結法，度量標準為歐氏平方距離，設置歐氏距離為5，將11批樣品聚為5類，如圖4所示。其中S7、S10、S11聚為一類，S3與S4聚為一類，S1與S2聚為一類，S5與S6聚為一類，S8與S9聚為一類，結果與相似度評價結果基本一致，說明藥材產地的不同對參芪復方浸膏的質量有一定的影響。

圖4 11批參芪復方浸膏供試品的聚類分析樹狀圖

2.3.3 主成分分析

將11批次參芪復方浸膏樣品的指紋圖譜的21個共有峰的峰面積作為評價指標，采用SPSS 22.0軟件對數據進行標準化處理后進行主成分分析，得到各主成分的特征值及貢獻率與主成分得分系數矩陣。表6結果顯示前3個主成分特征值均大于1，其中第一主成分特征值為14.833，方差貢獻率為70.634%，第二主成分特征值為3.315，方差貢獻率為15.787%，第三主成分特征值為1.884，方差貢獻率為8.97%，3個主成分的方差貢獻率達到95.391%，確定了3個主成分。主成分得分系數矩陣如表7所示，結果顯示峰9在第一主成分上有較高的荷載，峰7、峰18、峰19在第二主成分上有較高荷載，峰1、峰21在第三主成分上有較高荷載。

表6 參芪復方浸膏樣品前3個主成分的特征值及方差貢獻率

表7 主成分得分系數矩陣

根據各主成分載荷因子得分除以相應特征值的算術平方根計算得到各批次的綜合得分（表8）。依據綜合得分結果將11批次排序并分類。S3與S4得分最高，可以歸為一類，S1和S2歸為一類，S8與S9得分靠近，S10與S11得分最低歸為一類，其余歸為一類。由此可見，此結果與相似度分析及聚類分析的分類結果基本一致，說明不同產地的藥材成分有較大的差別。

表8 主成分綜合得分結果

3 討 論

中藥的成分復雜，質量控制難度較大。指紋圖譜為中藥提供了一個質量控制指標，因其具有特征性強、整體性和模糊性的特點，已被廣泛應用于中藥制劑的綜合評價和綜合控制。本研究針對參芪復方浸膏，考察了UHPLC的柱溫、檢測波長、洗脫梯度、洗脫溶劑、提取方法等對樣品復雜組分分離的影響，建立了UHPLC指紋圖譜分析方法，利用本品的指紋圖譜對其本品浸膏及其藥材進行質量綜合評價控制。所建方法高效、靈敏，較好地展現了本品浸膏及其藥材的組分分布和溯源，指紋圖譜中的相關峰峰面積精密度、重復性、穩定性的RSD均小于2.45%，相對保留時間的精密度、重復性、穩定性試驗的RSD均小于0.24%，反映出本法具有較好的穩定性和可控性。

中藥的質量和療效常受到多種成分的共同影響，所含化學成分眾多且復雜，因此成分鑒定難度較大。而液質聯用技術將液相色譜優異的分離性能與質譜高靈敏度、高選擇性的特點相結合，可以建立快速、高效的中藥成分分析方法。本研究中參芪復方浸膏由8種藥材煎煮而成，含有大量復雜化合物，但低分辨率質譜無法實現對未知復雜化合物的結構解析，因此采用UHPLC聯用Q-Exactive高分辨質譜對參芪復方浸膏供試品溶液進行分析，通過混合對照品HPLC色譜圖與參芪復方浸膏供試品色譜峰保留時間的對比分析，以及通過查閱文獻，分析裂解途徑，推斷組分的結構與名稱，確定了二十個在參芪復方浸膏中展現較好、峰形較為對稱、分離度良好的有效藥用成分，為后期將其作為質控指標的確定奠定了基礎。

通過對參芪復方浸膏指紋圖譜的研究，可以考察不同藥材原產地與參芪復方浸膏質量的影響。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統與數據分析軟件SPSS對11批參芪復方浸膏指紋圖譜相似度分析、聚類分析及主成分分析，3種評價方法所獲結果基本一致，將主要批次共聚為了5類，說明了不同產地藥材對參芪復方浸膏的質量有一定的影響，有可能導致臨床療效的差異，需要進一步分析產地與藥材有效成分質量的相關性。

基于指紋圖譜綜合性、整體性的特點，建立全面、多指標的中藥質量控制方法，在未來可以實現處方工藝生產的全程監控，從而保證不同批次間中藥質量的穩定，對于推進中藥的臨床應用，促進其進一步發展具有重要的意義。

4 結束語

本文利用超高效液相色譜（UHPLC）對參芪復方浸膏進行質量控制研究。建立了參芪復方指紋圖譜，并結合LC-MS/MS所獲得的碎片離子信息，成功鑒定20個共有峰的化學結構?；谥讣y圖譜，對11批參芪復方浸膏進行了相似度分析、聚類分析、主成分分析，考察了藥材不同產地對參芪復方浸膏質量的影響。該指紋圖譜方法被驗證對參芪復方浸膏的質量控制具有較強的專屬性與良好的穩定性，能較為全面、客觀的反應參芪復方浸膏的質量，也可用于對不同批次參芪復方浸膏的質量控制與評價，為提高和完善參芪復方浸膏的質量標準提供了參考和依據。該研究為進一步確定參芪復方浸膏質量控制的定量標志物，探尋外部因素對藥材有效成分質量的影響提供了基礎，通過全面的測定方法對藥材的生產加工過程進行監控，從而保證中藥復方的質量穩定可靠。