一種新的黨參根腐病害鐮孢菌鑒定＊

漆永紅，李敏權，曹素芳，龔成文，米永偉，武偉國，李雪萍，陳愛昌，孫新榮，李繼平

(1.甘肅省農業科學院植物保護研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省農業科學院林果花卉研究所，甘肅蘭州 730070；3.甘肅省農業科學院經濟作物與啤酒原料研究所，甘肅 蘭州 730070；4.定西市植保植檢站，甘肅 定西 743000；5.渭源縣農業技術推廣中心，甘肅 定西 748200）

黨參（Codonopsis pilosula）為桔梗科黨參屬，多年生草本植物，分布在我國北方山地林邊和灌叢中，海拔高度為1560～3100m。黨參作為傳統的補益藥，具有補中益氣和健脾益肺的功效[1-2]。根據黨參的外形和產地，可以分為西黨、潞黨、東黨和條黨等[3]。甘肅省定西市渭源縣是我國的“黨參之鄉”，主要生產白條黨參。隨著甘肅省黨參人工栽培面積逐年擴大，生長環境改變和土壤病原菌數量不斷積累，黨參根腐病害已成為制約其產量和品質的重要因素之一，對當地黨參產業發展受到嚴重的影響。

關于黨參根腐病害國內一些學者有研究，王艷等[4]報道了甘肅省渭源縣和隴西縣黨參根腐病病原菌為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporiums）。劉春葉等[5]發現，洛黨參根腐病在田間4 月中下旬發生，8月份達到高峰。余中蓮等[6]報道，尖孢鐮孢菌（F.oxysporiums）引起川黨參根腐病。近年來，一種新的黨參根腐病在我省黨參種植區普遍發生，當地農戶誤稱為“黃心病”，由于發病初期，葉片從綠色逐漸變為灰綠色和黃色，內部維管束由白色變為黃色、黃褐色、褐色至深褐色而得名。據前期調查發現，一般田間發病率為15%～30%，嚴重的達50%以上，甚至絕收；病原菌在土壤或帶菌參根上越冬，上年已感染參根在5 月中下旬發病，6～7 月為發病高峰期；當年的參根發病較晚，6 月中下旬出現發病癥狀，8月達到高峰期。該病害在我省黨參種植區的為害面積逐年增加，尤其以重茬黨參發病嚴重，給種植戶帶來巨大的經濟損失。關于該病害在我省臨洮縣、渭源縣、漳縣、宕昌縣、岷縣等地的病原種類未見報道，本試驗擬對我省發生的一種新的黨參根腐病的發病癥狀進行研究，以確定其病原、致病性及其優勢病原種類，為該病害的田間防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病樣采集與病原菌分離和純化

2018 年6 月在甘肅省臨洮縣、渭源縣、漳縣、宕昌縣、岷縣等主要黨參生產基地采集發病植株，記錄好采樣信息，裝入自封袋。采用常規組織分離法[7-8]，剪取發病維管束5mm×5mm 組織塊在75%酒精中浸泡5s，然后轉移至1.5%次氯酸鈉溶液中消毒1min，無菌水漂洗3 次晾干，置于PDA 培養基平板內，在25℃培養箱培養5～7d。從菌落邊緣切取菌絲塊置于香石竹葉片瓊脂（CLA）培養基（瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，每皿加入長度1cm 的無菌康乃馨葉片3 片），在25℃培養7～10d。將分離純化的菌株轉接至PDA 斜面，4℃保存備用。

1.2 致病性測定

采用柯赫氏法則進行致病性測定，將分離純化的病原物PDA 培養基打成10mm 菌餅接種在黨參（渭黨1 號）芽尖部，無菌土掩埋接種部位，每個病原菌接種15 株黨參幼苗，以沒有帶菌的PDA 培養基接種黨參芽尖部作為對照，45 d 后調查發病情況，病害分級標準為，0 級：根部無病斑；1 級：根部病斑面積占總根部面積的1/4 以下；3 級：根部病斑面積占總根部面積的1/4～1/2；5 級：根部病斑面積占總根部面積的1/2～3/4；7 級：根部病斑面積占總根部面積的3/4 以上。同時將發病部位再次分離培養，用形態學和分子生物學鑒定，確定分離得到的病原菌與初接病原菌是否為同一病原菌。

1.3 病原菌形態學鑒定

將病原菌分別接種在PDA 和CLA 培養基（促進產孢）上，25℃下培養7d 和10d 后，觀察并拍照記錄菌落形態、顏色、產孢結構與分生孢子形態、大小，根據Burgess[9]分類方法和標準進行病原菌種類鑒定。

1.4 病原菌分子生物學鑒定

1.4.1 真菌基因組DNA 提取

刮取PDA 培養基上的病原菌菌絲，采用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒E.Z.N.ATM.HP Fungal DNA Kit（OMEGA）的方法提取DNA[10]，保存于-20℃備用。

1.4.2 分子鑒定的引物

本試驗用鐮孢菌特異性引物[11-12]，核糖體內部轉錄間隔區ITS1 和ITS4 序列分別為TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和TCCTCCGCTTATTGATATGC；鐮孢菌特異性引物TEF1αF 和TEF1αR 的序列分別為 ATGGGTAAGGARGACAAGAC 和 GGARGTAC CAGTSATCATGTT。

1.4.3 PCR 擴增、凝膠電泳、測序及序列分析

PCR 擴增體系（25μL）：10×Buffer2.5μL、2.5mol·L-1dNTP4μL、10μmol·L-1正反向引物各1μL、Taq 酶0.5μL、DNA 模板1μL，用ddH2O 補足至25μL。PCR反應條件：94℃預變性10min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，25 個循環；72℃延伸10 min，4℃保存備用。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的序列與GenBank 核酸序列庫進行同源性比對分析，并用Mega 6.0Neighbor-joining 法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 發病癥狀

地上部葉片由綠色變成黃色和灰綠色（圖1A），出現急性萎蔫，早晚稍有恢復，天氣晴朗時很快全株萎蔫枯死。病原菌從黨參芽尖部侵入，發病初期，根外表正常，縱剖根部，內部維管束組織自上而下逐漸變為黃色、黃褐色、褐色至深褐色（圖1B）；健康植株的內部維管束組織呈白色（圖1C）。

圖1 黨參根腐病

2.2 病原菌在田間的分布及種類鑒定

共采集到黨參標樣23 份，室內分離到鐮孢菌株216 株。4 種鐮孢菌在每個縣區均有分布，對分離到的菌株進行鑒定和統計，尖孢鐮孢菌112 株，占51.85%；茄病鐮孢菌49 株，占22.69%；三線鐮孢菌和銳頂鐮孢菌為34 株和21 株，分別占15.74%和9.72%，其中尖孢鐮孢菌為黨參根腐病的優勢種群。各病原菌的培養性狀和形態學特征鑒定如下：

菌株編號WDX-4-2-2 尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）：在PDA 培養基上菌落白色，大型分生孢子鐮孢形，中間粗，兩端尖細，具3～5 個橫隔膜，多為3 個隔，大小為23.0～33.0μm×2.0～4.0μm，足胞明顯；小型分生孢子橢圓形，單胞，無色，大小為3.0～14.5 μm×1.5～3.0μm。

菌株編號DS-3-1-2 茄病鐮孢菌（F.sonali）：在PDA 培養基上菌落白色，較致密；大型分生孢子無色，較寬，兩端圓，馬特型，2～5 個隔膜，多為3 個隔膜，大小為20.0～38.5μm×3.5～5.5μm；小型分生孢子，橢圓形、腎形，無色，大小為6.5～15.0μm×2.5～4.5μm。

菌株編號DS-4-1 三線鐮孢菌（F.tricinctum）：在PDA 培養基上菌絲羊毛狀，繁茂，白色或粉紅色；大型分生孢子新月形，兩端漸尖，頂細胞彎曲并逐漸變細，足細胞明顯，3～5 分隔，28～50μm×2.5～5.5 μm；小型分生孢子橢圓形或檸檬形，0～1 隔，5.5～17.5μm×3.5～8.5μm。

菌株編號DS-3-1-1 銳頂鐮孢菌（F.acuminatum）：在PDA 培養基上菌絲白色，茂盛；大型分生孢子鐮刀形，通常4～6 分隔，32.5～82.5μm×2.0～5.5 μm；小型分生孢子紡錘形或腎形，0～1 分隔，多為0分隔。

2.3 病原菌分子生物學鑒定結果

測序結果與GenBenk 數據庫中Nucleotide Blast 進行比對，尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）、茄病鐮孢菌（F.sonali）、三線鐮孢菌（F.tricinctum）和銳頂鐮孢菌（F.acuminatum）的序列分別為597、544、483 和537bp。用Mega7.0 軟件，采用鄰接法構建系統發育樹，黨參根腐病與F.oxysporum、F.sonali、F.tricinctum和F.acuminatum 親緣關系最近（如圖2 所示）。結合形態學和分子生物學特征，把甘肅省臨洮縣、渭源縣、漳縣、宕昌縣、岷縣的黨參根腐病鑒定為尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）、茄病鐮孢菌（F.sonali）、三線鐮孢菌（F.tricinctum）和銳頂鐮孢菌（F.acuminatum）。

圖2 病原菌系統發育樹

2.4 4 種鐮孢菌對黨參的致病性測定結果

室內致病性測試結果表明，接菌植株表現出與自然病株相同的癥狀，未接菌植株表現正常，從接種發病黨參植株上全部分離到病原菌，形態學和分子生物學鑒定為尖孢鐮孢菌、茄病鐮孢菌、三線鐮孢菌和銳頂鐮孢菌。與對照相比，尖孢鐮孢菌、茄病鐮孢菌、三線鐮孢菌和銳頂鐮孢菌均對黨參有致病性，但發病率和病情指數不同（見表1）。尖孢鐮孢菌的致病性最強，發病率和病情指數最高，分別為100.0%和46.4，顯著高于茄病鐮孢菌、三線鐮孢菌和銳頂鐮孢菌，而茄病鐮孢菌、三線鐮孢菌和銳頂鐮孢菌對黨參的致病力較弱，三者差異不顯著。

表1 4 種鐮孢菌對黨參的致病性測定

3 討論

隨著黨參栽培面積的不斷擴大和連年種植，病蟲草害等有害生物的為害日益嚴重，給黨參生產造成的損失越來越大。本試驗針對當地農戶誤稱為黨參“黃心病”開展研究，結果發現是一種新的黨參根腐病，首次確定了該病害的發病癥狀和病原菌的侵染方式，病原菌從芽尖侵入，內部維管束自上而下變褐色，地上部葉片出現急性萎蔫，導致全株枯死。該病害在我省黨參種植區普遍發生，帶來巨大的經濟損失，嚴重影響了黨參產量提高和品質提升。

根腐病屬土傳病害，防治比較困難[13]，由于病原物在土壤中可以存活多年。鑒定黨參根腐病害的病原菌是防治的前提條件和基礎，明確病原種類對采取有效和科學的防治技術起到關鍵作用。本試驗初步明確了黨參根腐病的病原為尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）、茄病鐮孢菌（F.sonali）、三線鐮孢菌（F.tricinctum）和銳頂鐮孢菌（F.acuminatum），其中尖孢鐮孢菌為優勢種，這表明黨參根腐病害的病原種類復雜，存在多種鐮孢菌復合侵染的現象，進一步說明了田間黨參根腐病害為害的普遍性和嚴重性。同時，調查發現該病害主要為害根部和莖基部，發病癥狀隱蔽，早期識別和診斷難度大，一旦發病出現急性萎蔫，導致全株枯死，來不及進行防控，這也說明了提前采取有效的防治措施控制該病害的重要性。國內外的一些學者對其他植物病害通過環介導等溫擴增（LAMP）的方法進行快速檢測[14-17]，建立了快速、準確檢測病原菌的方法，對病害及時有效控制起到重要的指導作用，關于黨參根腐病害病原菌的快速檢測和病害診斷有待于進一步研究。

鐮孢菌是農業生產中為害最嚴重的土傳病原物之一，是一種常見的土傳病原菌，具有很強的寄生和腐生能力，同時會產生毒素[18-19]。鐮孢菌的致病性主要通過產生鐮孢菌酸毒素降低寄主植物的抵抗力，影響寄主植物的細胞代謝；產生細胞壁降解酶降解寄主植物的細胞壁防御組織和保護組織，致使寄主植物細胞內的營養物質釋放；產生一些蛋白物質影響病原菌在寄主植物根部定植和萌發，對寄主植物防衛物質解毒，使寄主植物失去防御能力[20]。本試驗僅明確了黨參根腐病害的發病癥狀、不同鐮孢菌的種類和優勢病原菌尖孢鐮孢菌，但關于不同鐮孢菌和黨參根腐病的致病機理有待于進一步研究。

黨參病害在高溫多雨、低洼積水、藤蔓繁茂和濕度大的連作地塊發病嚴重[21]。在黨參移栽前，盡可能平整地塊。本試驗由多種鐮孢菌引起的黨參根腐病可采用綜合方法來解決，其中農業防治最直接的措施就是施用充分腐熟的農家肥，遏制病原菌通過帶菌種子和種苗進行遠距離傳播。因中藥材的經濟效益驅動，長期輪作和休耕在我省大多數種植區難以實施，短期輪作可以起到緩解病害的為害，生產中建議黨參和其他禾本科作物輪作，避免連作和重茬。一些蟲害造成的傷口和病原菌復合侵染加重病害的發生[22]。在實際生產中，及時防治地下害蟲，培育和選擇無病蟲感染、無機械損傷和表皮光滑健康的種苗是減輕發病的有效措施。國內的一些學者通過化學藥劑和生物菌劑防治中藥材病害[23-27]。一些殺菌劑前期防效較好，但中后期防效較差，基于黨參對農藥殘留要求的特殊性，在種植前通過生物農藥進行土壤消毒和藥劑浸苗是預防黨參根腐病的重要措施之一。