DANCR通過AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路調控黑素瘤細胞活性機制的研究

李程彬 徐威龍 李婷 陳佳 舒茂國 賈晶

[摘要]目的：探索長鏈非編碼（Long non-coding，Lnc）RNA DANCR（Anti-differentiation nc RNA）在黑素瘤組織中表達及其對黑素瘤細胞的作用及其作用機制。方法：檢測黑素瘤和瘤旁組織中DANCR表達，及其與患者臨床預后的關系。在敲低DANCR的黑素瘤細胞株A375和B16中通過MTT和克隆形成實驗檢測敲低DANCR對細胞活性影響，通過Western-blot實驗檢測p-AKT，p-GSK3β和Cyclin D1表達，并通過細胞流式檢測細胞周期分布。通過過表達DANCR檢測其是否通過AKT/GSK3β調控細胞活性。結果：DANCR在黑素瘤組織中表達上調，并與黑素瘤不良臨床預后相關;敲低DANCR可抑制黑素瘤細胞活性，下調p-AKT、p-GSK3β和Cyclin D1表達;抑制AKT或GSK3β均可減弱DANCR過表達對細胞活性上調作用。結論：DANCR在黑素瘤中表達上調，激活AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路上調細胞活性，促進黑素瘤進展。

[關鍵詞]LncRNA DANCR;黑素瘤;細胞活性;增殖;AKT;GSK3β;Cyclin D1

[中圖分類號]R739.5? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）03-0086-04

DANCR was Upregulated in Melanoma Tissues and Promoted Cell Viability Via AKT-GSK3β-Cyclin D1 Signaling

LI Cheng-bin，XU Wei-long，LI Ting，CHEN Jia，SHU Mao-guo，JIA Jing

（Department of Plastic，Cosmetic and Maxilofacial Surgery，the First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University，Xian 710061，Shaanxi，China）

Abstract： Objective? To investigate the expression of long non-coding RNA DANCR in melanoma tissues， and the role and potential mechanism of DANCR in melanoma development. Methods? Detecting the expression of DANCR in melanoma and the adjacent tissues to analyze the relation of DANCR expression and clinical prognosis. Knocking DANCR down in melanoma cell lines， A375 and B16. Cell viability was detected using MTT and colony formation assays. Western blot assay detected the expression of p-AKT， p-GSK3β and Cyclin D1. Flow cytometry assay analyzed the distribution of cell cycle. DANCR-overexpressed cells were used to confirm that DANCR regulated cell viability via AKT/ GSK3β signaling. Results? DANCR expression was upregulated in melanoma tissues compared with the adjacent tissues， which was associated with poor clinical prognosis. Knocking DANCR down repressed cell viability and diminished expression of p-AKT， p-GSK3β and Cyclin D1. Inhibiting both p-AKT and p-GSK3β reversed DANCR overexpression induced enhancement of cell viability. Conclusion? DANCR was upregulated in melanoma cells and enhanced melanoma cell viability via modulating AKT-GSK3β-Cyclin D1 signaling.

Key words： LncRNA DANCR; melanoma; cell viability; proliferation; AKT; GSK3β; Cyclin D1

惡性黑素瘤（Melanoma）是惡性度最高的皮膚腫瘤。近年來，黑素瘤在我國發病率成倍增長[1]。一直以來，其易轉移，易復發的特點，加之目前并無針對性的治療方案，導致黑素瘤的愈后極差。小分子靶向藥物和免疫治療等新興療法延長了黑素瘤患者生存時間，但仍存在耐藥現象[2]。因此，深入研究黑素瘤發生發展分子機制以尋找新的治療靶點十分迫切。前期研究表明DANCR功能復雜，如對抗上皮組織細胞分化[3];抑制牙源干細胞和成骨細胞分化[4-5];在一定程度上與結腸癌不良預后相關[6]。此外，DANCR還可增加肝癌組織細胞干性，促進細胞生長和轉移[7-8]。敲低DANCR可明顯抑制乳腺癌細胞轉移[9]。本研究以DANCR為研究對象，初步探索DANCR在黑素瘤中的作用及其可能作用機制。

1? 材料和方法

1.1 材料：胎牛血清為HyClon產品;DMEM為中國碧云天產品;第一抗體：抗p-AKT（#9611），抗AKT（#4685），抗p-GSK3β（#5558），抗GSK3β（#12456）和抗Cyclin D1（#2978）購于CST（Cell Signaling Technology）科技公司。黑素瘤細胞株A375和B16購于美國ATCC;雙抗（青霉素和鏈霉素）、EDTA，二甲基亞砜（DMSO）和四氮唑藍（MTT）購于Invitrogen公司（美國）。LY294002（L9908）和LiCl（L4408）購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和穩定RNA干擾：人黑素瘤細胞株A375和B16分別培養于含有10%血清的DMEM培養基和高糖DMEM培養基中。細胞培養在適當濕度的培養箱中，溫度恒定于37℃。復制缺陷慢病毒用作轉染載體。其中包含了用于構建穩定敲除DANCR或過表達DANCR的shRNA或DANCR基因片段。慢病毒感染A375和B16細胞以構建穩定敲除DANCR或過表達DANCR的細胞株。實時定量PCR（qRT-PCR）技術用于檢測轉染效率。

1.2.2 RNA提取和實時定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測：總RNA提取試劑盒（上海飛捷生物技術有限公司）用于提取細胞中總RNA。1μg總RNA通過Superscript Ⅲ轉錄酶用于反轉錄（購于賽默飛）。所得反轉RNA繼續和SYBR Green共同用于qRT-PCR檢測，以分析靶基因的表達。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）用作內參。

1.2.3 Western blot檢測：RIPA細胞裂解液中加入蛋白酶抑制劑，之后用于裂解細胞。所提取的細胞裂解液離心留取蛋白溶解液，用Bradford法檢測蛋白濃度。之后每組吸取30μg蛋白加入12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離。待蛋白完全分離后，轉移分離開的蛋白條帶至硝化纖維素（Nitrocellulosefilter，NC）膜上。用5%的脫脂牛奶室溫孵育NC膜1h以封閉膜上非特異性結合位點。之后用特異性一抗在4℃孵育NC膜過夜。反復清洗NC膜，之后用辣根過氧化物酶二抗孵育NC膜，用成像儀觀察蛋白條帶。

1.2.4 組織獲取和激光捕獲微檢測：該研究所用標本為2014年6月-2017年9月在西安交通大學第一附屬醫院行手術切除的黑素瘤患者腫瘤標本。該研究經過西安交通大學第一附屬醫院倫理委員會批準，并全程遵循相關規定。標本收取和使用前，與患者進行了充分的溝通并簽署相關知情同意書。該研究遵循了1964年赫爾辛基公告及其之后的修訂。在病理醫生指導下，激光捕獲法分別切取黑素瘤組織和瘤旁組織。切割下的組織進行裂解并提取RNA，經反轉錄后行qRT-PCR檢測相應基因表達情況。

1.2.5 克隆形成實驗：細胞種于6孔板中（1 000細胞/孔），連續培養約兩周至單個克隆細胞數量約50細胞。棄去培養基，以4%多聚甲醇固定培養板中細胞，結晶紫染色約10min后，PBS洗滌培養板三遍，最終攝像并計數每孔中細胞克隆數量。

1.2.6 四氮唑藍（MTT）比色檢測：MTT檢測用于檢測細胞活性。5×103細胞種于96孔板中，培養箱中培養24h后改用無血清培養基繼續培養，或者用不同抑制劑處理。不同處理后細胞更換新鮮無血清培養基，加入MTT試劑（0.5mg/ml）在37℃培養4h。之后小心移除培養基，再加入150μl的DMEM，輕柔震動使結晶充分溶解，在490nm波長下使用微盤分析儀讀取各孔結晶濃度。每組設置5個重復孔。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞周期：當細胞培養至密度為60%～80%時即用胰酶/EDTA消化細胞以獲取細胞。獲取的細胞用PBS洗滌后，重懸于預冷的70%甲醇中，繼續在-20℃環境中放置24h。檢測前，離心以去除甲醇，繼續用冷PBS清洗兩次。之后再細胞中加入RNAse A （0.5μg/ml）和碘化丙啶（50μg/ml），繼續在室溫下培養于黑暗中。30min后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.8 統計學分析：本研究使用GraphPad prism 5軟件進行作圖和統計分析，Students t檢測用于兩組之間差異的統計分析。對于三組及以上各組間差異分析，用SPSS 17.0軟件通過單因素方差分析（ANOVA）和Fisher最小顯著性差異進行分析比較。P<0.05被定義為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 DANCR在惡性黑素瘤患者組織中表達情況：惡性黑素瘤患者中DANCR表達明顯高于瘤旁組織（P<0.05），見圖1A。進一步分析可知，DANCR的表達水平會隨著T分期升高而呈現表達上調，見圖1B。將黑素瘤患者按照DANCR表達水平分為兩組，分析其生存時間可知：DANCR高表達組生存預后較DANCR低表達組差，見圖1C。

2.2 敲低DANCR抑制惡性黑素瘤細胞活性：為進一步闡述DANCR在黑素瘤細胞中高表達所發揮的作用，使用攜帶靶向DANCR的short hairpin（sh）RNA慢病毒轉染細胞處理A375和B16，從而得到DANCR含量較低的目標細胞株，見圖2A。通過MTT檢測可見，敲低DANCR可抑制A375和B16的細胞活力，見圖2B。同樣，克隆形成實驗進一步支持了這一觀點：敲低DANCR可抑制其克隆形成能力，見圖2C。

2.3 敲低DANCR下調AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路并抑制細胞周期：為了探索DANCR調控A375和B16細胞活性的潛在分子機制，用Western-Blot檢測了目標細胞中相關蛋白表達水平的變化。結果表明：敲低DANCR的A375和B16細胞中p-AKT，p-GSK3β和Cyclin D1蛋白水平均出現了不同程度的下降，見圖3A。此外，細胞周期檢測分析可見，敲低DANCR可抑制細胞周期向S期和G2/M期轉換，更多細胞停留于G1期，見圖3B。

2.4 DANCR通過AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路調控黑素瘤細胞活性：為了證實AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路在DANCR調控細胞活動中所發揮的作用，用慢病毒為載體構建了DANCR過表達的細胞模型并檢測轉染效果，見圖4A。Western-Blot檢測可見，DANCR過表達上調p-AKT，p-GSK3β和Cyclin D1蛋白表達。而用LY294002在DANCR過表達細胞中抑制p-AKT活性后，可見p-AKT，p-GSK3β和Cyclin D1蛋白表達下調，見圖4B。DANCR過表達也可促進A375和B16細胞活性，同樣，LY294002可抑制DANCR過表達所引起的細胞活性增加，見圖4C。與其相一致的是，克隆形成實驗顯示DANCR過表達可促進克隆形成，而LY294002可減弱該促進作用，見圖4D。用LiCl抑制GSK3β以驗證其在DANCR調控細胞活性中的作用。Western-Blot實驗結果顯示，抑制GSK3β可有效逆轉DANCR過表達誘導的Cyclin D1上調，見圖4E。同樣，抑制GSK3β也可下調DANCR過表達引起的細胞活性增加（見圖4F）和克隆形成增強（見圖4G）綜上所述，圖4結果證實了AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路在DANCR調控細胞活性中所發揮的重要作用。

3? 討論

近年來，關于黑素瘤相關分子機制的研究取得了巨大的進展[10]，由于黑素瘤具有高度的侵襲性和強烈的致死性，黑素瘤患者仍不能逃離復發和死亡的命運[11]。因此，深入理解黑素瘤發生發展的分子機制，將幫助挖掘新的靶點，為改善黑素瘤患者臨床預后提供可能性。

隨著非編碼RNA在生物進程中的重要作用被不斷揭示，其功能研究和其表觀遺傳調控機制研究為攻克黑素瘤提供了新的方向。LncRNAs是一組內源性非蛋白編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA），其在黑素瘤發生發展中不同層面所發揮的作用也被不斷報道[12]。研究表明，很多LncRNA，如HOTAIR，MALAT1，BANCR，ANRIL，SAMMSON和SPRY-IT1，在黑素瘤細胞增殖、分化、侵襲遷移中發揮重要作用[12]。前期研究證實，LncRNA DANCR在多種腫瘤的進展作用重要，但目前關于DANCR在黑素瘤進展中作用尚不清楚。發現DANCR在黑素瘤組織中較瘤旁組織表達上調，與黑素瘤患者不良臨床愈合密切相關。介于黑素瘤往往帶來較差的臨床結局，以及其對傳統治療反應性較差，早期發現和診斷黑素瘤，進而早期進行臨床干預，就顯得尤為重要。因此，DANCR有望作為黑素瘤的一個新的診斷指標或成為黑素瘤治療后臨床進展的檢測指標。

PI3K/AKT信號通路在多種皮膚癌癥的發生發展中發揮著重要作用。因此，很多靶向PI3K/AKT的藥物被不斷挖掘出來，并證實可用于癌癥治療[13]。PI3K/AKT信號通路通過靶向相應靶基因調控細胞增殖、粘附、侵襲遷移和血管生成。已有研究證實，PTEN缺失和PI3K/AKT信號通路激活可見于大多黑素瘤[14]，而靶向抑制PI3K/AKT及其下游分子也可抑制黑素瘤進展[15]。本次研究結果提示，DANCR在黑素瘤中表達上調，通過PI3K/AKT信號通路促進細胞增殖和細胞周期。GSK3β是AKT信號通路的重要下游分子，在腫瘤進展中作用重要[16]。研究發現，DANCR上調GSK3β表達，而用LiCl抑制GSK3β可有效逆轉DANCR過表達所有誘導的細胞活性上調。

目前靶向PI3K/AKT信號通路的靶向藥物不斷問世，但前期臨床實驗顯示其效果仍欠理想[17]。而研究中所揭示的DANCR-AKT-GSK3β信號通路調控Cyclin D1表達影響黑素瘤細胞周期，有望為其治療提供新的靶點。此外，PI3K/AKT信號通路在癌細胞侵襲遷移中同樣作用重要;而DANCR也可促腫瘤侵襲遷移。考慮黑素瘤強侵襲遷移特性，靶向DANCR有望成為黑素瘤臨床治療的一個靶標。

本研究結果顯示，DANCR在黑素瘤組織中表達上調，可激活AKT-GSK3β-Cyclin D1通路發揮作用。這一發現為DANCR作為黑素瘤臨床治療補充靶點或作為黑素瘤診斷和預后的分子指標提供了一定的理論基礎。

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[收稿日期]2020-03-16

本文引用格式：李程彬，徐威龍，李婷，等.DANCR通過AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路調控黑素瘤細胞活性機制的研究[J].中國美容醫學，2021，30（3）：86-90.