IFN-γ對乳腺癌潰瘍創面組織中成纖維細胞的影響

李璐 尹燕鋒 楊越 楊鑫 高建虎

[摘要]目的：通過體外培養人乳腺癌難愈合創面中成纖維細胞，并應用TGF-β/Smad信號通路阻斷劑干擾素γ（IFN-γ）干擾后，探討IFN-γ在乳腺癌難愈合創面中所發揮的作用和影響。方法：采用酶消化法對人乳腺癌潰瘍創面組織行體外成纖維細胞原代培養。將實驗細胞分成A、B、C、D共四組，A組為IFN-γ 5 000U/ml組;B組為IFN-γ 10 000U/ml組;C組為對照組，不加藥物;D組為空白組。分別于第7天、第14天將培養細胞接種于96孔板內，用MTT法測定細胞增殖情況。結果：第7天及第14天A組吸光值與對照組C組比較差異無統計學意義（P>0.05）;B組吸光值均低于對照組C組，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論：IFN-γ對成纖維細胞的增殖抑制受到濃度的影響，濃度10 000U/ml時明顯抑制了體外培養成纖維細胞的增殖，而在較低濃度（5 000U/ml）時對體外培養成纖維細胞增殖無明顯抑制作用。

[關鍵詞]乳腺癌;成纖維細胞;干擾素γ（IFN-γ）;潰瘍創面;難愈合創面

[中圖分類號]R737.9? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）03-0099-03

Effect of IFN-γ on Fibroblasts in Wound Tissue of Breast Cancer Ulcer

LI Lu1 ，YIN Yan-feng2，YANG Yue1，YANG Xin1，GAO Jian-hu1

（1.Department of Breast Surgery; 2.Biomedical Research Center，Gan Mei Hospital Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650011，Yunnan，China）

Abstract： Objective? The role and influence of IFN-γ in refractory wounds of breast cancer were investigated by in vitro culture of fibroblast cells in refractory wounds of breast cancer and interference with IFN-γ （TGF-β/Smad signaling pathway blocker）. Methods? In vitro fibroblast primary culture was performed on the wound tissue of human breast cancer ulcer by enzyme digestion. The experimental cells were divided into four groups： group A， group B， group C and group D. Group A was IFN-γ 5 000U/ml group， group B was IFN-γ 10 000U/ml group; group C was the control group without drugs， group D was blank group. The cultured cells were inoculated into 96-well plates on the 7th and 14th day respectively， and cell proliferation was determined by MTT method. Results? There was no significant difference in OD value between group A and control group C on the 7th and 14th day（P>0.05）. The OD value of group B was lower than those of group C， the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion? The inhibition of IFN-γ on proliferation of fibroblasts was affected by the concentration， the concentration at 10 000U/ml significantly inhibited proliferation of fibroblasts cultured in vitro， while the lower concentration of IFN-γ at 5 000U/ml no obvious inhibitory effect on the proliferation of fibroblasts.

Key words： breast cancer; fibroblast; interferon-γ（IFN-γ）; ulcer wound; refractory wound

轉化生長因子-β（Transforming growth factor β，TGF-β）是一種多向性、多效性的細胞因子，以自分泌或旁分泌的方式通過細胞表面的受體信號轉導途徑調節細胞的增殖、分化、凋亡，對細胞外基質的合成、創傷的修復、免疫功能等有重要的調節作用[1]。TGF-β參與創面愈合的全過程[2]。Smad是指參與TGF-β細胞內信號傳導的相關蛋白，統一命名為Smad信號蛋白，是TGF-β受體作用的直接底物，是將配體與受體作用的信號由胞漿傳導至細胞核的中介分子[3]。本研究通過對體外培養成纖維細胞使用TGF-β/Smad信號通路阻斷劑干擾素-γ（IFN-γ）后，觀測體外培養的人乳腺癌難愈性創面成纖維細胞生長及細胞功能方面的變化，為了解TGF-β/Smads信號通路在人乳腺癌難愈性創面愈合過程中發揮的作用及其程度，探討促進人乳腺癌難愈性創面愈合的新方法。

1? 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：CDEM高糖培養基 （sigma）D6429-500ml;胎牛血清;DPBS（gibco）8113346;青霉素-鏈霉素（gibco）;MTT試劑盒（sigma）CGD1;0.25%胰酶（gibco）1213981;干擾素-γ（IFN-γ）購自上海克隆生物高技術有限公司;二甲基亞砜（DMSO）;96孔培養板;25cm2培養瓶;3cm培養基;CO2孵育箱;顯微鏡;微型震蕩儀;酶標儀等由昆明市第一人民醫院分子生物實驗中心提供。

1.2 標本來源：臨床常見人乳腺癌潰瘍創面組織，經過常規換藥3個月仍然難愈合的潰瘍創面組織且面積大于5cm×5cm，經過病理學活檢鑒定創面組織有乳腺癌浸潤生長。取該創面組織，采用酶消化法進行成纖維細胞的原代培養。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組：實驗細胞分成A、B、C、D共4組，A組為IFN-γ5 000U/ml組;B組為IFN-γ10 000U/ml組;C組為對照組，只有培養細胞，不加IFN-γ;D組為空白組，與實驗孔平行設置不加細胞只加培養液，其他實驗條件保持一致，用于比色時儀器調零。

1.3.2 細胞培養：①所得組織切除壞死組織（不小于1cm3），放于15ml離心管中（瓶中放加過雙抗的生理鹽水）;②用鑷子將組織從瓶子中取出，放入75%酒精的3cm培養皿中浸泡5～10s;③用加過雙抗的生理鹽水沖洗浸泡2遍（每次不少于10s）;④去除暴露在外的組織和脂肪組織，用4℃加雙抗的DPBS（gibco）8113346緩沖液沖洗組織2遍，置于0.25%胰酶（gibco1213981）中在4℃條件下孵育18h，用無血清的CDEM高糖培養基（sigma）D6429-500ml浸潤后置于干凈的3cm培養皿中;⑤將組織剪切成1～2mm3的小塊，將剪好的組織小塊排列于25cm2的培養瓶中，用marker筆標記好日期等信息;⑥將培養瓶置于37℃、5% CO2條件下孵育1～3h;⑦預熱二甲基亞砜（DMSO）完全后，將培養基置于37℃;⑧培養瓶中，每瓶加入5ml預熱好的青霉素-鏈霉素（gibco），其中含青霉素100U/ml、鏈霉素各100U/ml、胰島素40U/200ml和10%胎牛血清的CDEM高糖培養基（sigma）D6429-500ml中，置于37℃、5% CO2條件培養箱中培養;⑨以后每隔3d換1次培養液。

觀察到成纖維細胞于培養后第3天開始繁殖，由組織塊開始向四周擴展，于第3天加入干擾素γ（IFN-γ）（購自上海克隆生物高技術有限公司）。A組加入濃度為5 000U/ml的IFN-γ、B組加入濃度為10 000U/ml IFN-γ后繼續培養，隔日每組加入與之前同組別相同濃度的IFN-γ。分別于第7天、第14天分別取培養細胞用MTT法檢測細胞增殖情況。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖：①將實驗細胞接種于96孔板內，濃度為每孔104/200μl，繼續培養24h;②棄去細胞培養板中培養液，每孔中加入4mg/ml MTT試劑盒（sigma）CGD1溶液100μl，繼續培養4h;③終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO），在微型振蕩器上震蕩5min，使結晶充分溶解;④比色：選擇490nm波長，用D組空白組儀器調零，在酶標儀（由昆明市第一人民醫院分子生物實驗中心提供）上測定每孔光吸收值（OD值），并記錄結果。

1.4 統計學分析：數據用均數±標準差（x?±s）表示，采用SPSS 24.0 for windows統計軟件包進行配對t檢驗。處理檢驗水準α為0.05，P<0.05差異有統計學意義。

2? 結果

成纖維細胞于培養后第3天開始繁殖，由組織塊開始向四周擴展。分別于第7天（見圖1）、第14天（見圖2）分別取培養細胞，接種于96孔板內，用MTT法做細胞增殖的測定。第7天A組吸光值（OD值）為0.198±0.082與對照組C組0.201±0.008比較，差異無統計學意義（P=0.941>0.05）;B組吸光值（OD值）為0.145±0.013低于對照組C組0.201±0.008，差異有統計學意義（P=0.006<0.05）;第14天A組吸光值（OD值）為0.206±0.054與對照組C組0.189±0.052比較，差異無統計學意義（P=0.692>0.05）;B組吸光（OD值）值0.164±0.057低于對照組C組0.189±0.052，差異有統計學意義（P=0.012<0.05）。實驗表明IFN-γ在濃度10 000U/ml對體外成纖維細胞的增殖有抑制作用，而濃度5 000U/ml對體外培養成纖維細胞的增殖無明顯抑制作用。

3? 討論

眾所周知，TGF-β/Smad信號通路作為一個龐大的超家族，與創面愈合、疾病發生發展、腫瘤的發生發展密切相關[4]。TGF-β可同時作為腫瘤抑制物和腫瘤促進物存在，其作用的發揮在腫瘤早期起抑制作用，而在腫瘤后期起促進作用[5]。而這個作用是通過的TGF-β/Smad中成員的缺失突變，以及抑制型TGF-β調節來影響惡性腫瘤的發生發展[6]。Smad2和Smad4在人惡性腫瘤中的滅活表明他們是抑癌基因調節轉錄的重要分子，其突變或表達的失活與多種惡性腫瘤的發生發展有關[7]。TGF-β/Smad導致的生長抑制應答的缺失，易導致上皮細胞惡性腫瘤的產生[8]。

目前，已發現的Smad分子共有8種，其中Smad2，3，4，6，7與TGF-β的信號調控最為密切，并將這5種Smad按其功能分為3類：①受體調節型Smad，即Smad2與Smad3。配體與受體結合后，即能磷酸化Smad2，Smad3使其激活;②共用型Smad，即Smad4。Smad2與Smad3激活磷酸化后必須與Smad4形成復合物，才能遷移至胞核中促進靶基因表達;③抑制型Smad，包括Smad6和Smad7[9]。目前，對于Smad7阻斷TGF-β信號通路，以及其對器官纖維化的實驗研究成為廣大學者研究的熱點。Smad7可阻斷信號通路下調了TGF-β的細胞內信號傳導，減少其自身基因表達[10]。同時，Smad7的表達可以受到其他信號轉導通路的影響。比如，IFN-γ通過Jak1酪氨酸蛋白激酶和Stat1轉錄因子可以增強Smad7的表達，而達到抑制TGF-β的作用[11]。

本試驗通過體外培養乳腺癌難愈合創面中成纖維細胞并應用外源性IFN-γ增強Smad7的表達而抑制TGF-β/Smad信號通路，探討IFN-γ的作用及其影響。實驗取人乳腺癌潰瘍創面組織，進行體外細胞培養其成纖維細胞。采用酶消化法進行成纖維細胞的原代培養。通過本實驗結果說明IFN-γ在第7天和第14天均抑制了成纖維細胞的增殖。但是，IFN-γ對成纖維細胞增殖抑制受到濃度的影響，濃度在10 000U/ml明顯抑制了體外培養成纖維細胞的增殖。而IFN-γ在較低濃度5 000U/ml對體外培養成纖維細胞的增殖無明顯影響。說明，IFN-γ在濃度10 000U/ml對體外成纖維細胞的增殖有抑制作用，而濃度5 000U/ml時對體外培養成纖維細胞的增殖無明顯抑制作用。

通過阻斷TGF-β/Smads通路的信號轉導，觀測體外培養的人乳腺癌難愈合創面成纖維細胞生長及細胞功能方面的變化，濃度在10 000U/ml明顯抑制了體外培養成纖維細胞的增殖;IFN-γ對于創面愈合的影響是通過抑制成纖維細胞的生長增殖，增生緩慢，從而影響創面愈合。目前對于體外培養成纖維細胞應用外源性IFN-γ來阻斷TGF-β/Smad通路未見報道，本研究表明TGF-β/Smads信號通路在乳腺癌難愈合創面中所發揮的作用，為臨床促進乳腺癌難愈合創面愈合提供實驗數據和理論依據。將在今后實驗研究中進一步探討其藥理規律，為臨床藥物試驗提供理論依據，以便患者得到更為積極的藥物治療。

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[收稿日期]2019-10-25

本文引用格式：李璐，尹燕鋒，楊越，等.IFN-γ對乳腺癌潰瘍創面組織中成纖維細胞的影響[J].中國美容醫學，2021，30（3）：99-101.