PDZ結合激酶/T-LAK 細胞來源的蛋白激酶在惡性腫瘤中的作用機制研究進展△

宋開蓉，劉媛，陳思璐，楊永秀

1蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000

2甘肅省婦科腫瘤重點實驗室，蘭州 730000

3蘭州大學第一醫院婦產科，蘭州 730000

1 PBK/TOPK的發現

Gaudet等首次通過酵母雙雜交技術篩選鑒定出一種可與果蠅腫瘤抑制蛋白DLG的人類同源物（the human homologue of the Drosophila Discslarge tumor suppressor protein，hDlg）分子PDZ結構域相結合的新型蛋白激酶，命名為PDZ結合激酶（PDZ binding kinase，PBK）。經測序發現，其與Abe等克隆并命名的淋巴細胞激活的殺傷T細胞源性蛋白激酶（T-LAK cell-originated protein kinase，TOPK）屬于同一分子，故統稱為PBK/TOPK。PBK/TOPK和促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK）的同源性很高，分子量約為40 kD，編碼322個氨基酸，含有所有蛋白激酶的特征性亞結構域和鋅指結構域，是MAPKK家族新成員。因PBK/TOPK缺失了一些對催化活性至關重要的氨基酸序列，故其本身無活性，需要某些氨基酸殘基[如蘇氨酸（threonine，Thr）-9、Thr-198）]被磷酸化后才能具備催化活性。

2 PBK/TOPK 在正常組織中的表達

在人類正常組織中，PBK/TOPK的表達及分布隨著生長發育時間的變化而發生變化。在胎兒的肺、脾、腎、睪丸及腦組織中均可檢測到PBK/TOPK，而在成人正常組織中，PBK/TOPK主要在心肌、胰腺、睪丸、胎盤等部位被檢測到，尤其是胎盤。Fujibuchi等進一步研究發現，在精子產生的過程中，PBK/TOPK僅在增殖旺盛的精母細胞中呈高表達，而在精原細胞和精子中呈陰性表達。然而，Dougherty等的研究顯示，PBK/TOPK不能在無增殖活動的成熟神經細胞中和處于靜止期的神經干細胞中被檢測到，主要定位于存在神經多能祖細胞等具有快速增殖能力的細胞的區域，如出生后早期的小腦顆粒層和成人的室管膜下區。上述研究表明，PBK/TOPK高表達于有增殖空間的組織中，提示與細胞增殖密切相關。

3 PBK/TOPK 與細胞有絲分裂

一項利用沉默RNA（silencing RNA，siRNA）技術敲除PBK/TOPK的實驗結果顯示，當PBK/TOPK的表達受到抑制時，紡錘體中央區出現變形和模糊，細胞質移動受阻，導致細胞周期推遲或停滯，說明PBK/TOPK參與了紡錘體中間帶形成和細胞有絲分裂。PBK/TOPK在細胞有絲分裂期被磷酸化激活，于G期和M期的表達上調，此種變化與細胞周期蛋白B1（cyclin B1）一致，并通過促進細胞周期蛋白依賴性激酶1（cylcin-dependent kinase 1，CDK1）/cyclin B1復合體的表達，磷酸化多梳抑制復合物 1（polycomb repressive complexes 1，PRC1），加快細胞的有絲分裂。當PBK/TOPK與抑癌因子p53的DNA結合結構域（DNA-binding domain，DBD）相結合時，p53的表達量降低，下游細胞周期調控蛋白的功能受到抑制，導致異常有絲分裂的發生，進一步導致腫瘤形成。

4 PBK/TOPK與惡性腫瘤

PBK/TOPK主要通過激活多條細胞內信號通路促進多種細胞因子的分泌，引起機體內一系列腫瘤基因或轉錄因子的表達量發生變化，參與調控細胞周期，提高腫瘤細胞的存活、增殖、侵襲、遷移及抗凋亡能力等，從而促進腫瘤的發生、發展（圖1）。

圖1 PBK/TOPK 影響腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的作用機制

4.1 PBK/TOPK與呼吸系統腫瘤

Wang等發現，鼻咽癌組織中高表達的PBK/TOPK與病情的嚴重程度呈正相關，下調PBK/TOPK的表達可誘導大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生，并激活p38絲裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）/c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路，介導鼻咽癌細胞凋亡，抑制鼻咽癌細胞增殖和集落形成。PBK/TOPK可通過促進磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）的表達，抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表達，促進下游蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）磷酸化，加快肺癌細胞遷移。肺腺癌細胞系中表達下調的腫瘤抑制因子微小RNA（microRNA，miRNA）-216b-3p可通過直接負調控PBK/TOPK的表達從而抑制肺腺癌細胞的生長，發揮抑制腫瘤生長的作用。

4.2 PBK/TOPK與消化系統腫瘤

PBK/TOPK在口腔鱗狀細胞癌中過表達，而在人正常口腔黏膜中不能被檢測到，PBK/TOPK的高表達可能提示口腔癌患者的預后良好。有研究發現，PBK/TOPK可通過磷酸化Y盒結合蛋白1（Y box binding protein 1，YB1）激活 AKT/雷帕霉素靶蛋 白（mechanistictargetofrapamycin kinase，MTOR）/p70核糖體蛋白 S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）信號通路，促進食管鱗狀細胞癌細胞增殖；還可通過γ-catenin激活Src/糖原合酶激酶 3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）/信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）和細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信號通路從而參與食管鱗狀細胞癌細胞的轉移過程。Ohashi等發現，PBK/TOPK 在胃癌細胞系及原發性胃癌標本中均呈高表達，是胃癌患者預后不良的獨立危險因素（P＜0.05）。下調PBK/TOPK的表達可激活p53通路，從而抑制胃癌細胞的增殖；通過上調PTEN的表達可抑制胃癌細胞的侵襲和遷移。He等利用免疫組化及組織芯片等技術發現，在大部分膽管癌細胞中高表達的PBK/TOPK在所有肝細胞肝癌中完全不表達，這一特性運用于臨床將有助于膽管癌和肝細胞肝癌之間的鑒別；進一步研究發現，PBK/TOPK與膽管癌患者的預后呈負相關，表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）的刺激可上調PBK/TOPK的表達，影響細胞周期進程，提示PBK/TOPK可能參與了EGF-表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路的活化。與之相悖的是，有研究發現，PBK/TOPK在肝細胞癌中的表達明顯上調，通過沉默肝細胞癌細胞SMMC-7721中PBK/TOPK基因后發現，cyclin B1蛋白的降解速度明顯加快，腫瘤細胞的增殖能力明顯下降，AKT的磷酸化水平明顯降低，并由此推測PBK/TOPK可能通過激活PI3K/AKT信號通路促進SMMC-7721細胞生長。PBK/TOPK在肝細胞肝癌中表達的差異可能與標本來源各異、實驗方法及技術不同、樣本量較小等有關，有待進一步探究。在結腸癌HCT116細胞內，ERK2與PBK/TOPK可相互磷酸化形成一個正反饋循環，從而促進腫瘤細胞生長。PBK/TOPK還可通過與抑癌因子p53的DBD結合，降低后者的表達量，起到促進直腸癌細胞增殖、克隆并抑制凋亡的作用。另有研究表明，白細胞介素-8（interleukin-8，IL8）可誘導PBK/TOPK的表達上調，促進腸癌細胞系抵抗失巢凋亡，且PBK/TOPK高表達是結直腸癌患者預后不良的標志。一項基于組織芯片的回顧性分析進一步發現，腸癌患者的預后還與PBK/TOPK的定位有關，其中，PBK/TOPK于細胞質中低表達且于細胞核中不表達的腸癌患者，預后最差。

4.3 PBK/TOPK與泌尿生殖系統腫瘤

在乳腺癌細胞MCF7（抗雌激素藥物敏感株）中，PBK/TOPK可激活P38，進而磷酸化組蛋白H2AX，參與DNA損傷修復，提升細胞的運動性能，加快非貼壁依賴型乳腺癌細胞的生長速度；在乳腺癌細胞T47D（抗雌激素藥物耐藥株）中，PBK/TOPK可通過調控PI3K/AKT/ERK1/ERK2信號通路提高腫瘤細胞的增殖、侵襲能力，并參與血管的生成，促進乳腺癌的發生、發展。PBK/TOPK還可通過磷酸化組蛋白H3的Ser10、Leu-Gly-Asn重復富集蛋白/G蛋白信號調制器2（Leu-Gly-Asn repeat-enriched protein/G-protein signaling modulator 2，LGN/GPSM2）的 Thr450，影響細胞有絲分裂，進而調節乳腺癌細胞的增殖能力。Sun等研究發現，PBK/TOPK在前列腺癌中的表達量與腫瘤分級、腫瘤分期密切相關，即PBK/TOPK的表達水平越高，腫瘤級別越高，且PBK/TOPK在前列腺癌循環腫瘤細胞中的表達量比在前列腺癌原代癌細胞中更高，通過調節PBK/PTEN和ERK通路可促進前列腺癌的轉移。另有報道稱，PBK/TOPK能激活β-catenin-TCF/LEF信號通路，上調基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9的表達，故PBK/TOPK在發生侵襲、轉移的前列腺癌細胞中的表達水平較高。膀胱癌組織中PBK/TOPK mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織，有利于膀胱癌細胞BIU-87的增殖和遷移。Luo等發現，宮頸癌組織中PBK/TOPK的相對表達量明顯高于高級別宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）組織，且與腫瘤直徑、分化程度、侵襲情況、轉移情況、組織學類型和臨床分期等有關，可能有助于高級別CIN與宮頸癌的鑒別診斷。

4.4 PBK/TOPK與血液系統腫瘤

惡性淋巴瘤組織中PBK/TOPK的陽性表達率高于健康人淋巴結反應性增生組織，而其表達情況在霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）與非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma，NHL）之間無明顯差異，但在NHL中，高侵襲性淋巴瘤（如淋巴母細胞淋巴瘤）中PBK/TOPK的陽性表達率高于惰性淋巴瘤（如成熟B細胞淋巴瘤），提示TOPK的表達水平可能與NHL的惡性程度呈正相關，根據PBK/TOPK的表達量可大致推測出NHL的病理類型。在惡性淋巴瘤中，原癌基因c-myc可調控E2F轉錄因子 1（E2F transcription factor 1，E2F1）的活性，上調TOPK的表達，說明PBK/TOPK與惡性腫瘤細胞的增殖密切相關。

4.5 PBK/TOPK與其他惡性腫瘤

在惡性黑色素瘤細胞中，Zykova等研究發現，高表達的PBK/TOPK能夠促進Ser-32處過氧化物還原酶1（peroxiredoxin 1，Prx1）的磷酸化，抑制惡性腫瘤細胞凋亡。Oh等發現在紫外線的刺激下，PBK可與JNK1相結合，導致PBK-JNK1-c-Jun信號通路被激活，進而激活核轉錄因子激活蛋白1（activator protein-1，AP-1），誘導皮膚癌發生。TOPK與p53結合后可使抑癌基因p53失活，促進纖維肉瘤細胞生長。尤文肉瘤中，當抑制尤文肉瘤-友人白血病病毒整合1（Ewing sarcoma-friend leukemia integration 1，EWS-FLI1）異位融合后，PBK/TOPK的表達下調，可抑制細胞的增殖及聚集性生長能力。另有研究表明，PBK/TOPK的mRNA和蛋白的表達水平在膠質母細胞瘤中均升高，且與患者的生存期呈負相關。

5 PBK/TOPK與腫瘤耐藥

腫瘤耐藥是造成腫瘤化學治療失敗的主要原因，也是目前臨床上治療惡性腫瘤的最大障礙。PBK/TOPK參與腫瘤耐藥的形成，與腫瘤治療的有效性降低有關。

既往研究表明，在對EGFR治療耐藥和存在BRAF或KRAS突變的結腸癌患者中，高表達的PBK/TOPK參與EGFR治療的耐藥過程，而應用TOPK抑制劑可使30%～40%的結腸癌患者獲益；在存在FMS樣酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3）突變且FLT3抑制劑治療抵抗的急性髓細胞樣白血病患者中，抑制PBK/TOPK功能的靶向治療也可達到緩解病情的作用。PBK/TOPK可通過激活c-Jun S63和S73，提高AP-1的轉錄活性，提高AP-1靶基因CCND1和CDC2的表達水平，從而誘導肺癌細胞對EGFR抑制劑吉非替尼產生耐藥性。過表達的PBK/TOPK可明顯降低奧沙利鉑的抗腫瘤作用，提示PBK/TOPK可能介導了結腸癌細胞對奧沙利鉑的耐藥性，而miRNA-216b-TOPK軸可能是治療大腸癌的重要分子藥物靶點。PBK/TOPK缺失可抑制G/M期檢查點的激活，促進染色體畸變、多核和凋亡，可使肺癌、前列腺癌、宮頸癌、膀胱癌和喉癌等腫瘤細胞系特異性放射增敏。因此，PBK/TOPK的檢測可用于指導腫瘤患者術后輔助放化療。

6 PBK/TOPK抑制劑

PBK/TOPK抑制劑通過抑制PBK/TOPK的活性，阻斷PBK/TOPK下游信號通路，抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，從而達到抑制腫瘤生長的作用。近年來，關于PBK/TOPK抑制劑在各種惡性腫瘤中的作用機制及臨床效果的研究取得明顯進展。

6.1 針對PBK/TOPK結構設計合成的化合物

Kim等首次提取出能抑制PBK/TOPK蛋白活性的合成化合物，其中，HI-TOPK-032可顯著上調p53的表達，提高caspase 7、CDC2、多腺苷二磷酸核糖聚合酶 [poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等在細胞中的磷酸化水平，并明顯降低PBK/TOPK下游分子ERK、核糖體S6激酶（ribosomal S6 kinase，RSK）的磷酸化水平，有效促進結腸癌細胞凋亡。該抑制劑尚未應用于臨床，但在小鼠移植瘤模型實驗中暫未發現嚴重不良反應。Matsuo等發現了OTS514和OTS964兩種藥物，這兩種藥物可能會造成嚴重的造血功能障礙，但其脂質體形式抑制劑基本無毒性。兩者可抑制肺癌細胞A549、乳腺癌細胞LU-99以及原代卵巢癌細胞和小鼠卵巢癌移植瘤模型的生長，還可協同母體胚胎亮氨酸拉鏈蛋白激酶（maternal embryonic leucine zipper kinase，MELK）抑制劑誘導腎腫瘤細胞凋亡。研究發現，OTS514還能上調FOXO3及其轉錄靶點 CDKN1A（P21）和 CDKN1B（P27）的表達，誘導人骨髓瘤細胞系凋亡。

6.2 臨床發現的TOPK抑制活性藥物

降血脂藥物阿托伐他汀可通過抑制甲羥戊酸途徑和香葉酰化，失活Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）信號通路，下調PBK的表達，從而抑制雌激素受體（ER）陰性表達的乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖，對ER陽性表達的乳腺癌細胞MCF7的增殖無明顯影響。抗生素頭孢拉定也可作為PBK/TOPK的抑制劑，以時間、劑量依賴的方式抑制下游分子p38、JNK、ERK1/2和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65等的磷酸化，下調第139位絲氨酸磷酸化的組蛋白H2AX（the phosphorylation of histone H2AX at Ser 139，γ-H2AX）基因的表達，抑制白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎性因子的分泌，可用于治療紫外線引起的皮膚疾病，如日光性皮炎、銀屑病、惡性黑色素瘤和基底細胞癌等。臨床上，用于胃食管反流病、消化性潰瘍的泮托拉唑也是一種PBK/TOPK抑制劑，能抑制結直腸腫瘤的生長。Zheng等推測其他質子泵抑制劑類藥物也可能具有此抗腫瘤活性，并通過實驗證實，艾普拉唑可以有效抑制TOPK下游分子的活性，明顯減低組蛋白H3的磷酸化，起到抑制結直腸癌細胞生長的作用。上述幾種藥物運用于臨床多年，其不良反應已研究得較為透徹，對于藥品開發，不僅降低了成本，還節省了時間。可用作男性避孕藥的多酚化合物棉酚也可明顯抑制PBK/TOPK磷酸化，誘導白血病HL-60細胞分化，雖然使用棉酚后可能會出現低鉀血癥、肝功能損害等不良反應，但相較于白血病，這些不良反應更易治療。

6.3 從自然界直接提取的PBK/TOPK抑制劑

咖啡中富含的酚類植物化學物質（如咖啡酸、綠原酸）能夠以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）非競爭性的方式與PBK/TOPK相互作用，抑制其活性，從而抑制結腸癌發生肺部轉移。無毒化合物巖藻多糖（fucoidan）能抑制TOPK/ERK1/ERK2/絲裂原和應激激活蛋白激酶1（mitogen-and stress-activated protein kinase 1，MSK1）信號通路的激活，抑制EGF誘導的細胞發生惡性轉化。從甘草中提取的甘草香豆素可下調PBK/TOPK的磷酸化水平，從而激活p53，抑制肝癌細胞的增殖，并誘導其凋亡。姜黃素和人參皂苷Rh2可與PBK/TOPK直接結合，以劑量依賴的方式降低PBK/TOPK下游信號因子ERK1/2和H3的磷酸化水平，誘導結腸癌細胞HCT116凋亡。芍藥醇能以濃度依賴的方式靶向抑制PBK/TOPK，減少日光性皮炎的發生。黃芩苷在體內外均可通過直接與PBK/TOPK結合抑制TOPK的活性，降低肺癌細胞的增殖速度。越來越多的中藥成分被發現具有抑制PBK/TOPK活性的作用，在今后的研究中，中國學者應利用本國優勢，大力開發傳統中草藥的醫用價值。

由于胎兒體內也存在大量PBK/TOPK，因此，PBK/TOPK抑制劑不能應用于妊娠期婦女。另有研究發現，在局部缺血或再灌注損傷的腦組織、心肌細胞及腎臟中，PBK/TOPK可發揮抗炎、抗氧化等作用，保護神經細胞，修復心肌，并通過激活TOPK-PTEN-AKT信號通路保護腎臟，提示PBK/TOPK可能是臨床治療缺血再灌注損傷的潛在治療靶點，而患有缺血或再灌注損傷的腫瘤患者應禁用其靶向抑制劑。

7 小結與展望

隨著對PBK/TOPK介導的信號通路及其影響的細胞因子的不斷研究，調控腫瘤細胞增殖、存活、侵襲、轉移、抵抗凋亡及耐藥形成等方面的機制逐漸清晰，但在部分腫瘤中的作用機制仍不十分明確，有待進一步探索。PBK/TOPK抑制劑能夠特異性結合PBK/TOPK，目前，有關PBK/TOPK抑制劑的研究相對較多，且在細胞株和移植瘤動物模型試驗中顯示出了良好的抗腫瘤效應，在腫瘤靶向治療方面具有很好的臨床價值和應用前景。然而，PBK/TOPK抑制劑的開發大多還處于臨床前研究階段或臨床試驗階段，并未真正應用于臨床腫瘤治療領域。盡管如此，PBK/TOPK的重要作用是有目共睹的，相信越來越多的特異性PBK/TOPK抑制劑將會被應用于腫瘤的基礎和臨床研究中，為腫瘤患者及家庭帶來新的希望。