微小RNA-218-5p 對膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制

孫鑫波，陳從波，陳緒華，黃力

十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）1泌尿外科，2皮膚科，湖北 十堰 442000

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)、化療等雖有一定療效，但復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍較高，近年來靶向治療成為一個(gè)新的治療方向。微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)部分異常表達(dá)的miRNA與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有報(bào)道顯示，miRNA-218-5p通過負(fù)調(diào)控高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖；下調(diào)miRNA-218-5p可通過調(diào)節(jié)HMGB1促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-218-5p在膀胱癌組織中低表達(dá)，但其對膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制尚不清楚。98序列相似的家族成員A（family with sequence similarity 98，member A，F(xiàn)AM98A）基因定位于人類染色體的2p22.3，研究發(fā)現(xiàn)其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)，如FAM98A在子宮內(nèi)膜癌中過表達(dá)，與其預(yù)后不良有關(guān)，F(xiàn)AM98A缺乏可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。下調(diào)FAM98A可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖能力而抑制細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等，在腫瘤進(jìn)展中起重要作用。有研究報(bào)道，抑制PI3K/AKT信號通路可提高紫杉醇對膀胱癌T24細(xì)胞的殺傷作用，提高化療效果。姜黃素通過增加同源性磷酸酶張力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表達(dá)，抑制PI3K/AKT信號通路的激活而誘導(dǎo)人膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miRNA-218-5p是否通過FAM98A及PI3K/AKT信號通路影響膀胱癌細(xì)胞的增殖和凋亡，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常膀胱組織細(xì)胞SV-HUC-1和膀胱癌細(xì)胞BIU-78、T24、EJ均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒均購自美國Sigma公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自日本TaKaRa公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；MTT試劑盒、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Thermo FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常膀胱組織細(xì)胞SV-HUC-1和膀胱癌細(xì)胞BIU-78、T24、EJ分別用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO飽和濕度條件下培養(yǎng)，每天換液1次，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對數(shù)生長期的BIU-78細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miRNA-con、miRNA-218-5p、si-con、si-FAM98A、anti-miRNA-con和anti-miRNA-218-5p分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞BIU-78中，分別記為miRNA-con組、miRNA-218-5p組、si-con組、si-FAM98A組、anti-miRNA-con組和anti-miRNA-218-5p組，未進(jìn)行任何處理的BIU-78細(xì)胞作為空白對照組（NC）；將miRNA-218-5p分別與pcDNA-con和pcDNA-FAM98A共同轉(zhuǎn)染至細(xì)胞BIU-78中，分別記為miRNA-218-5p+pcDNA-con組和miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組，轉(zhuǎn)染均按照Lipofectamine2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測miRNA-218-5p和FAM98AmRNA表達(dá)水平 收集以上各組細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃3 min；95℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。相對表達(dá)量采用2法計(jì)算。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白表達(dá) 收集以上各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，10 340 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗（1∶1000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶2000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 MTT 法檢測細(xì)胞增殖率 在以上各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時(shí)加入20 μl的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處光密度（optical density，OD）值。細(xì)胞增殖率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞后離心收集，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測波長488 nm和530 nm處的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測miRNA-218-5p對FAM98A 的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示

FAM98A

3'UTR區(qū)域有miRNA-218-5p結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含有miRNA-218-5p結(jié)合位點(diǎn)的

FAM98A

-3'UTR野生型及突變型報(bào)告基因載體，在BIU-78細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-218-5p和野生型、突變型報(bào)告基因載體。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報(bào)告基因檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌細(xì)胞和人正常膀胱組織細(xì)胞系中miRNA-218-5p和FAM98A 表達(dá)情況的比較

與人正常膀胱組織細(xì)胞SV-HUC-1相比，膀胱癌細(xì)胞BIU-78、T24、EJ中miRNA-218-5p表達(dá)水平均降低，

FAM98A

mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）（圖1、表1）。因miRNA-218-5p和FAM98A表達(dá)在BIU-78細(xì)胞中與正常細(xì)胞差異最明顯，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用BIU-78細(xì)胞。

表1 膀胱癌細(xì)胞和人正常膀胱組織細(xì)胞系中miRNA-218-5p、FAM98A表達(dá)情況的比較（±s）

圖1 Western blot 檢測膀胱癌細(xì)胞和人正常膀胱組織細(xì)胞系中FAM98A 蛋白的表達(dá)情況

2.2 過表達(dá)miRNA-218-5p對BIU-78膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與miRNA-con組相比，miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中cyclin D1、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）表達(dá)水平均降低，miRNA-218-5p、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）表達(dá)水平均升高，細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（圖2、圖3、表2）

表2 NC組、miRNA-con組、miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中各蛋白及細(xì)胞增殖、凋亡情況的比較（±s）

圖2 流式細(xì)胞儀檢測NC組、miRNA-con組、miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細(xì)胞凋亡情況

圖3 Western blot檢測NC組、miRNA-con組、miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細(xì)胞cyclin D1、BAX和Bcl-2蛋白表達(dá)情況

2.3 敲減FAM98A對BIU-78膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與si-con組相比，si-FAM98A組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中BAX表達(dá)水平升高，F(xiàn)AM98A、cyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平均降低，細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（圖4、表3）

表3 NC組、si-con組、si-FAM98A組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中各蛋白及細(xì)胞增殖、凋亡情況的比較（±s）

圖4 Westernblot檢測NC組、si-con組、si-FAM98A組BIU-78膀胱癌細(xì)胞cyclin D1、BAX和Bcl-2蛋白表達(dá)情況

2.4 miRNA-218-5p靶向FAM98A

通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到FAM98A與miRNA-218-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miRNA-218-5p分別與

FAM98A

野生型及突變型報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染后，野生型BIU-78細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低（

P

＜0.01）；而突變型BIU-78細(xì)胞的熒光素酶活性變化不顯著（

P

＞0.05）（表4）。Western blot檢測結(jié)果顯示，相較于miRNA-con組，miRNA-218-5p組BIU-78細(xì)胞中FAM98A表達(dá)水平降低（

P

＜0.05）；相較于antimiRNA-con組，anti-miRNA-218-5p組BIU-78細(xì)胞中FAM98A表達(dá)水平升高（

P

＜0.05）（圖5、表5）。

表4 miRNA-con或miRNA-218-5p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BIU-78細(xì)胞后熒光素酶活性的比較（±s）

表5 miRNA-con組、miRNA-218-5p組、anti-miRNA-con組、anti-miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中FAM98A蛋白表達(dá)情況的比較（±s）

圖5 Western blot檢測miRNA-con組、miRNA-218-5p組、anti-miRNA-con組、anti-miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中FAM98A 蛋白表達(dá)情況

2.5 過表達(dá)FAM98A對BIU-78膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與miRNA-con組相比，miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中BAX表達(dá)水平升高，F(xiàn)AM98A、cyclin D1、Bcl-2表達(dá)水平均降低，細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）；與miRNA-218-5p+pcDNA-con組相比，miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中BAX表達(dá)水平降低，F(xiàn)AM98A、cyclin D1、Bcl-2表達(dá)水平均升高，細(xì)胞增殖率升高，細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（圖6、表6）

表6 miRNA-con組、miRNA-218-5p組、miRNA-218-5p+pcDNA-con組、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中各蛋白及細(xì)胞增殖、凋亡情況的比較（±s）

圖6 Western blot檢測miRNA-con組、miRNA-218-5p組、miRNA-218-5p+pcDNA-con組、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中FAM98A、cyclin D1、BAX和Bcl-2蛋白表達(dá)情況

2.6 PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá)情況的比較

與miRNA-con組相比，miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中p-PI3Kp85、p-AKT表達(dá)水平均降低（

P

＜0.05）；與miRNA-218-5p+pcDNA-con組相比，miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中p-PI3Kp85、p-AKT表達(dá)水平均升高（

P

＜0.05）。（圖7、表7）

表7 miRNA-con組、miRNA-218-5p組、miRNA-218-5p+pcDNA-con組、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中p-PI3Kp85和p-AKT表達(dá)情況的比較（±s）

圖7 Western blot檢測miRNA-con組、miRNA-218-5p組、miRNA-218-5p+pcDNA-con組、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細(xì)胞中p-PI3Kp85和p-AKT 蛋白表達(dá)情況

3 討論

膀胱癌的發(fā)病率和病死率呈逐年增長趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的健康。研究發(fā)現(xiàn)miRNA可充當(dāng)抑癌基因或促癌基因參與膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡和藥物敏感性等。在非小細(xì)胞肺癌中miRNA-218-5p低表達(dá)，通過表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。miRNA-218-5p還通過PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路靶向EGFR抑制翼狀胬肉上皮細(xì)胞的增殖和遷移。此外，拮抗miRNA-218-5p可減弱WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并減少三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移性骨病。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miRNA-218-5p在膀胱癌細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)miRNA-218-5p可抑制BIU-78膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)BAX表達(dá)，抑制cyclin D1、Bcl-2表達(dá)。

有報(bào)道顯示，F(xiàn)AM98A是腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和集落形成所需的蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（protein arginine methyltransferase 1，PRMT1）的新型底物。敲除

FAM98A

可抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺癌中FAM98A高表達(dá)，F(xiàn)AM98A通過p38-ATF2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)AM98A在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲減

FAM98A

可抑制膀胱癌細(xì)胞BIU-78增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)BAX表達(dá)，抑制cyclin D1、Bcl-2表達(dá)。此外，miRNA-218-5p靶向負(fù)調(diào)控FAM98A的表達(dá)，過表達(dá)FAM98A能逆轉(zhuǎn)miRNA-218-5p對膀胱癌細(xì)胞BIU-78的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。PI3K/AKT信號通路是參與細(xì)胞增殖調(diào)控的重要通路之一，既有抗凋亡作用又有促凋亡作用，以抗細(xì)胞凋亡為主。鈣黏蛋白13（cadherin 13，CDH13）下調(diào)表達(dá)通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖和克隆形成。抑制miRNA-130b-3p通過上調(diào)PTEN表達(dá)，抑制PI3K-AKT及整合素β1/黏附斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）信號通路的激活，誘導(dǎo)凋亡，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)miRNA-218-5p抑制PI3K/AKT信號通路中p-PI3Kp85和p-AKT蛋白的表達(dá)，而過表達(dá)

FAM98A

能逆轉(zhuǎn)miRNA-218-5p對p-PI3Kp85和p-AKT表達(dá)的抑制作用，說明miRNA-218-5p可能通過調(diào)控

FAM98A

進(jìn)而影響PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，miRNA-218-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與FAM98A及PI3K/AKT信號通路有關(guān)，將可為膀胱癌的預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn)。