甲狀腺乳頭狀癌中SKA3蛋白的表達及其與預后、免疫細胞浸潤的關系

杜春平，莫穎禧，曾麗霞，陳肖瑜，羅文奇，黃 靜，馬 韻

甲狀腺癌是常見的內分泌惡性腫瘤之一，包含多種病理類型，其中甲狀癌乳頭狀癌是最常見的類型[1-2]。紡錘體與著絲粒相關蛋白3(spindle and kinetochore associated protein 3, SKA3)參與介導動粒與微管的相互作用，并調節細胞的增殖和凋亡。SKA3在腫瘤中過表達，且與腫瘤細胞增殖和患者預后有關[3-4]。目前尚無SKA3在甲狀腺癌中的研究報道。本實驗通過免疫組化和多個甲狀腺乳頭狀癌研究隊列的大數據，分析SKA3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達、預后及其分子意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年6月～2020年4月廣西醫科大學附屬腫瘤醫院存檔的行根治術的甲狀腺組織標本，包括21例甲狀腺乳頭狀癌和16例正常甲狀腺組織。本實驗經廣西醫科大學附屬腫瘤醫院醫學倫理委員會審批，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化免疫組化染色采用SP法檢測系統(北京中杉金橋公司，SP-9000)，SKA3抗體(Bioss公司，1 ∶800稀釋，bs-7848R)。實驗步驟嚴格按試劑盒說明書操作，EDTA抗原修復液修復。結果判讀：著色強度呈淺黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分，無陽性著色為0分；陽性細胞比例<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。上述兩項結果乘積作為SKA3最終表達結果。分析人類蛋白質表達圖譜(https://www.proteinatlas.org)中SKA3抗體(HPA039272)在20種腫瘤組織切片中的陽性率。

1.2 數據來源甲狀腺乳頭狀癌隊列分別來自基因芯片公共數據庫(Gene Expression Omnibus, GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)的GSE3467隊列和GSE33630隊列；癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov)的THCA隊列。GSE3467和GSE33630隊列的基因表達芯片數據分別包含17例(腫瘤7例、配對正常標本7例)和90例(腫瘤45例、配對對照標本45例)。THCA隊列的RNA測序數據和臨床數據包含572例樣本(腫瘤513例、對照標本59例)。

1.3 數據分析GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)軟件分析SKA3 mRNA在GSE3467隊列和GSE33630隊列中的表達。UCSC Xena(https://xenabrowser.net)軟件分析SKA3 mRNA在THCA隊列中的表達。R軟件(https://www.r-project.org)分析THCA隊列的轉錄組數據，篩選與SKA3相關的差異表達基因。R軟件對差異基因進行基因本體論(Gene ontology, GO)富集分析。TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer)軟件分析THCA隊列中腫瘤組織的RNA測序數據，分析SKA3與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等免疫細胞的關系。

1.4 統計學分析采用R軟件進行統計學分析。t檢驗和ROC曲線分析SKA3蛋白表達，用平均數表示。秩和檢驗分析SKA3 mRNA表達及與臨床病理特征的關系，用中位數表示。以SKA3 mRNA中位數為參照，分為低表達組和高表達組；Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗比較SKA3低、高表達組間的預后。皮爾森相關檢驗篩選SKA3相關的差異表達基因，篩選標準為：P<0.05，r>0.4或<-0.4。皮爾森χ2檢驗分析SKA3與免疫細胞的相關性。

2 結果

2.1 癌組織中SKA3蛋白的表達免疫組化結果顯示(圖1)，與正常甲狀腺組織(1.375±0.154 8)相比，SKA3蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織(5.857±0.448 7)中的表達顯著上調(P<0.001，圖2)。ROC曲線示，SKA3具較高的診斷價值(AUC=0.981，圖3)。SKA3在甲狀腺乳頭狀組織中的陽性率高于其他腫瘤(圖4)。

AB

圖2 散點圖分析SKA3蛋白在正常組織和甲狀腺乳頭狀癌中的表達

圖3 ROC曲線顯示SKA3在甲狀腺乳頭狀癌中的特異性和敏感性

圖4 SKA3在20種腫瘤組織中的陽性率比較

2.2 癌組織中SKA3 mRNA的表達應用3個甲狀腺乳頭狀癌隊列，合計565例甲狀腺乳頭狀癌組織和111例對照組織，分析SKA3 mRNA的差異表達。與正常甲狀腺組織(GSE3467：5.783；GSE33630：5.166；THCA：2.555)相比，SKA3 mRNA在3個甲狀腺乳頭狀癌隊列中的表達均上調(GSE3467：6.012，P<0.001；GSE33630：5.530，P<0.001；THCA：3.792，P<0.001)(圖5)。

圖5 SKA3 mRNA在正常組織和癌組織的差異表達：A.GSE3467隊列；B.GSE33630隊列；C.THCA隊列

2.3 SKA3與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征和預后的關系THCA隊列用于SKA3 mRNA與患者臨床病理特征的分析，SKA3在N1期(3.981)的表達水平高于N0期(3.630)(P<0.001，圖6)。SKA3在性別(P=0.626)、年齡(P=0.623)、病理分期(P=0.428)、T分期(P=0.707)、M分期(P=0.084)中的表達差異無統計學意義。SKA3高表達組的無瘤生存期(P=0.003)和無進展生存期(P=0.017)均低于低表達組(圖7)；但在總生存率(P=0.393)和疾病特異生存率(P=0.741)方面差異無統計學意義。

圖6 SKA3 mRNA在N分期中的表達分析

圖7 SKA3表達與甲狀腺乳頭狀癌患者預后的關系：A.無瘤生存期；B.無進展生存期

2.4 SKA3共表達基因及其功能生物信息學篩選獲得與SKA3的共表達基因532個，其中正相關者有506個(P<0.05，r>0.4)，負相關者有26個(P<0.05，r<-0.4)。GO分析顯示，這些基因參與的生物學過程主要是：細胞有絲分裂、細胞周期調控、細胞周期檢查點、DNA損傷檢查點、腫瘤壞死因子的產生、MAP激酶活性的調節、白細胞遷移、淋巴細胞遷移、淋巴細胞聚集、中性粒細胞遷移等。

2.5 SKA3與腫瘤免疫細胞浸潤的關系TIME軟件分析顯示，SKA3與B細胞(P<0.001，r=0.415)、CD8+T細胞(P<0.001，r=0.255)、CD4+T細胞(P<0.001，r=0.271)、巨噬細胞(P<0.001，r=0.244)、中性粒細胞(P<0.001，r=0.426)和樹突狀細胞(P<0.001，r=0.51)的浸潤水平呈正相關。

3 討論

本實驗用4個獨立的甲狀腺乳頭狀癌隊列，比較SKA3在正常組織和腫瘤組織中的表達水平。SKA3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達顯著上調，具有一定的診斷價值。甲狀腺乳頭狀癌淋巴結轉移率高，是腫瘤高復發的危險因素[5]。SKA3在N1期患者中的表達水平顯著高于N0期患者，提示SKA3高表達可能與淋巴結轉移或腫瘤復發有關。SKA3高表達組患者的無瘤生存期和無進展生存期低于低表達組，提示SKA3高表達患者的預后更差。綜上所述，SKA3表達上調可能與甲狀腺乳頭狀癌的發生和預后有關。

GO分析顯示多種生物過程可能與SKA3基因有關，如細胞有絲分裂、細胞周期調控、細胞周期檢測點等。SKA3是紡錘體與著絲粒相關蛋白復合體的重要亞基，與NDC80復合物共同控制和調節細胞的有絲分裂，對細胞的增殖和凋亡有調節作用[6]。GO分析還發現SKA3可能與腫瘤免疫細胞浸潤有關。進一步分析發現，SKA3與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈正相關。腫瘤組織周圍活化的免疫細胞可通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子，以促進腫瘤細胞的增殖[7]。甲狀腺癌中淋巴細胞浸潤水平與免疫反應和細胞因子的分泌升高相關[8]。SKA3高表達患者的腫瘤免疫細胞增多，可能是影響其惡性生物行為，腫瘤浸潤免疫細胞受宿主免疫狀態的影響，可被藥物有效靶向，并與免疫治療的臨床療效相關[9-10]。

本實驗結果提示，SKA3對甲狀腺乳頭狀癌可能具有一定的影響，可能作為預后和治療的標志物。