SPIN1通過調控上皮-間質轉化促進胃癌細胞的遷移、浸潤

呂蓓蓓，劉海亭，陳 旭，王亞文，宋 琳，高 鵬

胃癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，最新研究數據顯示其病死率位居第3位[1]。由于其癥狀隱匿，難以早期發現，胃癌患者確診時多已為中晚期，5年生存率不足20%，嚴重危害國民的身體健康。浸潤與轉移是導致胃癌患者死亡的主要原因。目前關于胃癌浸潤、轉移的分子機制仍不明確。SPIN1又名Spindlin1，是SPIN/SSTY基因家族的主要成員，1997年Oh等[2]首次報道其為從卵母細胞向胚胎過渡過程中在小鼠中表達的主要母體轉錄物，在配子發生中發揮重要作用。此外其還是一種Tudor結構域蛋白，能夠識別組蛋白H3第四位賴氨酸甲基化(H3K4me3)，通過與其結合從而影響表觀遺傳調控[3-4]。近年研究表明，SPIN1在多種人類惡性腫瘤如卵巢癌、肺癌、肝癌及乳腺癌中高表達[5-7]，提示SPIN1可能是一個重要的癌基因，參與腫瘤的發生和發展。但迄今為止，SPIN1在胃癌中的表達水平、生物學功能和調控的分子機制仍不清楚，本文從細胞水平探究SPIN1對胃癌遷移、浸潤的作用，并初步探究其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑本實驗所用胃癌細胞株MKN45、BGC823、SGC7901、AGS及HGC27細胞購自中國科學院細胞庫上海腫瘤研究所。細胞培養基(RPMI-1640)購自Invitrogen公司，胎牛血清FBS購自Gibco公司，胰蛋白酶、雙抗、PBS干粉、DMSO購自索萊寶公司，細胞轉染試劑Turbofect購自Thermo公司，細胞轉染試劑X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent購自Roche公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自Roche公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司，引物購自濟南博尚公司，SPIN1抗體購自Proteintech公司(19531-1-AP)，vimentin、Zeb1、Zo-1、β-catenin、Snail、Slug、Claudin-1和β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和轉染 常規用RPMI-1640(Hyclone公司，USA)和10%胎牛血清(Gibco公司，USA)在37 ℃，5%CO2孵箱中培養。本課題組前期已構建SPIN1過表達質粒[7]，通過銳博公司人工合成靶向SPIN1的干擾序列(si-SPIN1)。然后將SPIN1過表達質粒和si-SPIN1及相應的對照分別轉染至胃癌細胞株BGC823，使SPIN1表達上調/下調。質粒轉染時選用Turbofect轉染試劑，siRNA及對照轉染選用X-tremeGENE轉染試劑。

1.2.2RNA提取和qRT-PCR檢測 (1)培養箱取出細胞后棄去培養基，用PBS清洗3次，根據貼壁細胞的數量酌情加入適量的Trizol裂解細胞；根據試劑盒說明書的步驟提取細胞內總RNA，然后使用反轉錄試劑盒(TOYOBO)將RNA反轉錄為cDNA，后續進行qPCR驗證。(2)使用Roche Universal SYBR Green Master進行實時熒光定量PCR檢測，10 μL反應體系：SYBR Green(2×)5 μL，F primer(30 μm)0.1 μL，R primer(30 μm)0.1 μL，cDNA 1 μg，Nuclease-Free Water補足10 μL。(3)反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，合計40個循環。(4)結果分析：選用GAPDH為內參，每個樣本的Ct值為2個復孔的Ct平均值，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)，以相對表達量=2-△Ct計算。

1.2.3Western blot法 分別收集實驗組和對照組的細胞沉渣，然后加入混合好的RIPA裂解混合液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，搖床孵育30 min(置于冰上)。孵育結束后4 ℃離心25 min(12 000 r/min)。收集上清液于新的EP管中。檢測總蛋白濃度，然后將每個樣品及蛋白marker上樣至10%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳2 h之后轉膜至PVDF膜，采用5%封閉液(40 mL TBST+2 g奶粉)封閉2 h，洗膜后將膜放于一抗4 ℃搖床孵育過夜，再次洗膜后放于二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，最后滴加顯影液顯影、拍照。

1.2.4Transwell實驗 (1)遷移實驗：培養箱取出轉染24 h后的胃癌細胞，胰酶消化后計數，實驗組和對照組各取5×104個細胞用200 μL無血清培養基懸浮后加入普通Transwell小室內，沿小室外孔加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，孵箱內孵育24 h后觀察結果。(2)浸潤實驗：Transwell小室內提前均勻加入稀釋好的基質膠(培養基 ∶基質膠=4 ∶1)，凝固后即可使用。其余步驟與細胞遷移實驗的操作步驟相同，細胞數增加至8×104個。(3)24 h后，將小室內的培養基吸出，用棉簽小心擦凈小室內膜面未穿出的細胞。將小室置于800 μL 4%多聚甲醛中，固定穿出外膜的細胞20 min，然后用結晶紫溶液染色15 min，小心用雙蒸水沖洗、棉簽擦凈，顯微鏡下拍照計數。(4)分析結果：在倒置顯微鏡下，實驗組及對照組隨機選取3個視野分別計數穿過小室的細胞數，計算其平均值，然后進行統計分析。

1.3 統計學分析使用GraphPad Prism 5及SPSS 20.0軟件進行統計學分析，使用t檢驗分析兩組間的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5種胃癌細胞系中SPIN1的表達量通過qRT-PCR檢測5種胃癌細胞系中SPIN1的相對表達量，結果顯示在胃癌細胞系中，SPIN1在轉移性胃癌細胞系SGC7901中的表達量最高，在HGC27的表達量最低(圖1A)。

2.2 轉染SPIN1質粒及si-SPIN1后BGC823中SPIN1的表達量在胃癌細胞系BGC823中轉染SPIN1質粒后，與轉染PCDNA 3.1的對照組相比，SPIN1的表達量明顯升高(圖1B)，轉染si-SPIN1后，與對照組相比，SPIN1的表達量明顯降低(圖1C)。

圖1 SPIN1在5種胃癌細胞系中的表達及BGC823細胞中過表達及干擾效率驗證：A.各胃癌細胞系中SPIN1的表達；B.轉染SPIN1后BGC823細胞中SPIN1的表達變化，***P<0.001；C.轉染si-SPIN1后BGC823細胞中SPIN1的表達變化，**P<0.01

2.3 SPIN1表達對胃癌細胞BGC823遷移及浸潤能力的影響Transwell實驗結果表明，過表達SPIN1后，BGC823細胞穿透Transwell小室底濾膜的細胞數比對照組明顯增多(P<0.05)，提示遷移、浸潤能力增強。而相比于對照組，si-SPIN1組中BGC823細胞穿透Transwell小室底濾膜的細胞數明顯減少(P<0.05，圖2)，提示細胞遷移及浸潤能力降低。

ASPIN1PCDNA3.1遷移浸潤Bsi-SPIN1NC遷移浸潤

2.4 SPIN1對上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的調控作用通過Western blot法檢測過表達/沉默SPIN1后BGC823細胞中EMT相關蛋白vimentin、Zeb1、Zo-1、β-catenin、Snail、Slug及Claudin-1的表達水平變化。結果表明，與對照組相比，過表達SPIN1后Slug表達上調，Claudin-1表達下調；干擾SPIN1后Slug表達下調，Claudin-1表達上調，其余蛋白未見明顯變化(圖3)。

圖3 過表達及干擾SPIN1后對EMT相關蛋白Slug及Claudin1表達的影響：A.過表達SPIN1；B.干擾SPIN1

3 討論

胃癌是導致中國癌癥死亡的主要原因之一，盡管化療是中晚期胃癌患者主要的治療手段，可適當延長患者總生存期，但化療的不良反應突出，且易導致耐藥。隨著對胃癌發生、發展分子機制的深入研究，胃癌的分子靶向治療越來越受到臨床的關注。目前針對胃癌的靶點主要包括EGFR、HER-2、VEGF、VEGFR、mTOc-MET、HGF等，除應用曲妥珠單抗使得少數HER-2陽性晚期胃癌患者部分獲益外，其他靶向藥物的臨床療效不盡人意。因此，尋找在胃癌發生、發展中敏感和特異的基因改變，并研究其發揮作用的分子機制，對胃癌的臨床診治及提供抗癌藥物的新靶點等方面均具有重要的理論和實際意義。

越來越多的證據表明，SPIN1是個新穎的癌基因，在腫瘤的發生、發展中起重要作用[5-6,8-9]，但在胃癌中尚未見相關研究。本實驗首先在細胞水平驗證了SPIN1在胃癌細胞系中高表達，且在淋巴結轉移細胞系SGC7901中表達量最高，結果提示SPIN1可能與胃癌的浸潤、轉移密切相關。轉移和浸潤是惡性腫瘤的基本特征，胃癌的遠處轉移和浸潤深度是影響患者預后的重要因素。后續我們將在臨床樣本水平進一步探究SPIN1表達與胃癌患者預后的關系。接下來為了明確SPIN1在胃癌遷移、浸潤中的作用，本實驗以BGC823細胞為研究對象進行了Transwell實驗。結果表明過表達SPIN1可以促進胃癌細胞的遷移、浸潤，而沉默SPIN1表達可以抑制胃癌細胞的遷移、浸潤，進一步驗證了SPIN1在胃癌浸潤、轉移中發揮重要作用。

目前對SPIN1發揮促癌作用的分子機制研究尚在初始階段，下游只有少數靶基因被報道，更為廣泛的分子調控機制仍待研究。EMT是腫瘤侵襲、轉移的重要機制之一，在胃癌的浸潤、轉移中發揮重要作用[10]。腫瘤細胞通過發生EMT，失去上皮極性而獲得間質特性，主要表現為細胞黏附分子如E-cadherin、Zo-1等表達減少，而vimentin、纖維結合蛋白等細胞骨架蛋白表達上調，同時與EMT相關轉錄因子Snail家族表達異常增加等[11]。Slug是Snail鋅指家族的轉錄因子之一，是EMT的重要標志物，在多種惡性腫瘤中表達升高[12]，且與胃癌的不良預后密切相關[13]。本實驗結果表明，在胃癌細胞系BGC823細胞中過表達/沉默SPIN1可以上調/下調Slug的表達，提示SPIN1可能通過調控Slug表達促進EMT進程。Claudin-1是緊密連接蛋白Claudins家族的成員之一，是重要的細胞間連接蛋白，與EMT的發生密切相關，研究發現Claudin-1在胃癌組織中表達明顯降低，具有抑制胃癌細胞生長、侵襲和轉移的功能[14]。本實驗結果顯示，SPIN1過表達可以抑制Claudin-1表達，而沉默SPIN1可以上調Claudin-1表達，表明SPIN1參與調控Claudin-1的表達。Martinez-Estrada等[15]研究發現Claudin-1是上皮細胞中Snail家族因子的直接下游靶基因。因此我們推測SPIN1對Claudin-1的調控作用可能是通過Slug實現的。在后續的研究中我們將繼續深入研究這一分子機制。

綜上所述，本實驗選用胃癌BGC823細胞為研究對象，初步探討了SPIN1在胃癌遷移、浸潤中的作用及其對EMT的調控作用，為胃癌的發生、發展及轉移評估提供了新的標志物，其更深入的分子機制有待進一步探索。