固本暢樞法對肥胖糖尿病大鼠糖脂代謝及胰島β細胞凋亡的影響*

唐咸玉，孫 璐，何 柳，曾慧妍，何嘉莉，謝雯雯，朱勝伶

(廣東省中醫院，廣州 510120)

我國超重人群中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患病率高于美國(15.45% vs. 8%～9%)[1]，糖尿病合并肥胖存在的糖脂代謝紊亂可啟動內質網應激，導致胰島β細胞凋亡[2]，加速糖尿病的進展。改善糖脂代謝、抑制糖脂毒性誘導的內質網應激、減少β細胞凋亡可能成為防治肥胖T2DM的新途徑。中醫認為，此類患者的主要病機為脾腎陽虛、樞機不利、痰瘀內阻。前期臨床研究證實，運用具有“溫補脾腎之陽，和暢樞機”功用的固本暢樞法可改善肥胖T2DM 患者胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)，減輕其體質量及臨床癥狀[3]。本研究復制肥胖糖尿病大鼠模型，通過體內實驗了解固本暢樞法對模型大鼠糖脂代謝的影響，以及胰腺β細胞凋亡時典型的形態學改變；通過體外培養小鼠胰島β細胞MIN6，采用流式細胞術定量分析β細胞凋亡情況。本文運用生物化學、形態學與定量分析相結合，旨在進一步研究固本暢樞法對胰島β細胞凋亡的干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物及飼養

無特定病原體動物(specific pathogen free，SPF)級成年雄性sprague-dawley(SD)大鼠，體質量140～160 g共40只，購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號SCXK(粵)2013-0002，實驗動物倫理學批準號2016054。SPF組鼠料為廣東省醫學實驗動物中心供應(飼料合格證號0082700)。高脂高糖飼料由北京博愛港公司提供，組分包括玉米、豬油、蔗糖、膽固醇、豆粕、小麥麩、次粉、魚粉、麻油、大豆油、磷酸氫鈣、石粉、膽酸鈉、賴氨酸、食鹽、氯化膽堿、多種維生素及礦物元素。維持料65%+豬油10%+蔗糖20%+膽固醇2.5%+膽酸鈉1%+混調劑(雞蛋麻油花生)1.5%。

1.2 細胞及培養

小鼠胰島β細胞MIN6(廣州銘善上生物科技有限公司提供)，細胞復蘇后將MIN6細胞用含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、5μl/Lβ-巰基乙醇的DMEM-高糖培養基于37 ℃、5%CO2培養箱內培養。

1.3 藥物

固本暢樞方組成：熟附子10 g，茯苓20 g，山藥20 g，干姜10 g，丹參15 g，蒼術10 g，黨參20 g，玄參10 g，葛根30 g，黃芪30 g，大棗15 g，柴胡10 g，黃芩6 g，法半夏10 g。藥材由廣東省中醫院藥房提供，經藥劑科鑒定均為純正藥材。將中藥制成粗粉，煎藥取汁并過濾，置于水浴箱內濃縮成含生藥2.2 g/mL的混懸液，藥液常溫冷卻后置于4 ℃冰箱內保存備用。

1.4 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)(sigma公司，貨號S0130)；TUNEL試劑盒(Roche公司，貨號11684795910)；原位熒光標記試劑盒(DAPI)(Roche公司，貨號11684817910)；甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein，HDL-C)測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號分別為A110-2、A111-1、A113-1、A112-1)；胰島素ELISA試劑盒(Mercodia公司，貨號10-1247-01)；胎牛血清、RPMI-1640培養基、DMEM-高糖培養基、青鏈霉素(Hyclone，貨號分別為Cat.No.SH30087.01、Cat.No.SH30809.01B、Cat.No.SH30022.01B、Cat.No. SH30010)；β-巰基乙醇(BBI公司，貨號ZY60)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(keygen，貨號KGA106)；96孔板細胞培養板(NEST，Cat.No.PPP-001-030)；HERACELL150i型細胞恒溫培養箱(Thermo scientific)；Multiscan MK3型酶標儀(Thermo Fisher Scientific)；FACSCalibur型流式細胞儀(BD)； DMI6000B型倒置熒光顯微鏡(Leica)；CM10 型透射電鏡(Philips)；1X71型顯微成像系統(日本Olympus)。

2 方法

2.1 造模、分組及干預方法

SPF級成年雄性SD大鼠隨機分為正常對照組(10只)及模型組(30只)，正常對照組給予普通飼料喂養，模型組給予普通飼料適應性喂養1周，再給予高糖高脂飼料喂養8周后，按30 mg/kg單次腹腔注射STZ溶液，72 h后尾靜脈采血測定其空腹血糖及空腹胰島素水平(禁食8 h以上)，糖尿病大鼠模型的確立標準是空腹血糖≥11.1 mmol/L，未成模者剔除。造模成模率為86.7%，成模后大鼠按隨機數字表法分為治療組及模型組各13只。治療組及模型組繼續給予高糖高脂飼料喂養，治療組以18.8 g/(kg·d)劑量每日2次灌胃固本暢樞方混懸液，正常對照組和模型組灌胃等量蒸餾水，持續給藥4周，所有組別均未出現大鼠死亡。

MIN6細胞分為正常組、凋亡模型組(8.3 mmol/L的葡萄糖+5 μL/Lβ-巰基乙醇+2μg/mL衣霉素培養24 h)和含藥血清組(凋亡模型+10%含藥血清)。

2.2 標本采集

2.2.1 血清標本采集 給藥結束后各組大鼠尾靜脈穿刺采血測血糖；心臟穿刺采血，離心分離血清，-80 ℃保存備用。

2.2.2 組織及細胞標本采集 各組大鼠心臟穿刺采血后處死，無菌操作取出胰腺、肝臟、大腿肌肉組織、脂肪組織，分別切取部分組織(胰腺宜取胰尾)在4%多聚甲醛液中固定4～6 h，常規石蠟包埋，待做HE染色及TUNEL、DAPI檢測。MIN6細胞懸液從細胞培養板中轉移到一個干凈的離心管內，離心保存備用。

2.3 指標檢測及方法

2.3.1 血糖、血脂及胰島素測定 TG、TC采用GPO-PAP酶法，LDL、HDL采用直接法，空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)采用葡萄糖氧化酶法，空腹胰島素(fasting insulin，FINS)采用ELISA測定，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。計算胰島素敏感性指數(IAI)：IAI=1/(G0+I0)[I0為空腹血胰島素，G0為空腹血葡萄糖]。

2.3.2 胰腺、肝臟、大腿肌肉及脂肪組織的病理變化 石蠟包埋的組織切取5 μm 厚的切片，將切片進行HE 染色，用光學顯微鏡觀察以上4種組織的病理變化并攝片。每組選3只大鼠，分別取胰臟、肝臟、大腿肌肉組織、脂肪組織，切至0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小，固定于2.5%戊二醛液中，經PBS 漂洗、丙酮梯度脫水、Epon812包埋后，LKB超薄切片機切片，透射電鏡下觀察細胞超微結構的變化并攝片。

2.3.3 TUNEL-DAPI共染色法檢測胰腺細胞的凋亡 TUNEL染色法：將石臘包埋的胰腺組織切片進行脫臘、水化，PBS漂洗，蛋白酶K(1∶10 PBS 稀釋)37 ℃孵育10～20 min后PBS漂洗2次，甩干(擦干)組織周邊，檢測樣本和陽性對照樣本，加入TUNEL reaction mixture 50μL，陰性對照樣本加入Label Solution，37 ℃濕盒避光孵育60 min，PBS漂洗3次，封閉內源性過氧化物酶活性，在脫氧核苷酸末端轉移酶(terminal deoxynucleotidy transferas, TDT)與熒光素連接的核苷酸混合緩沖液內孵育，NBT-BCIP顯色。陰性對照不加TDT。陽性細胞呈現藍色熒光。

DAPI染色法：用中性樹膠圈定組織片的界限，加入200 μL RNase A，37 ℃避光作用30 min，滴加300μL PBS，滴加60μL DAPI飽和工作液搖勻，室溫下避光作用10 min棄染液，PBS洗滌3次，封片后熒光顯微鏡下觀察(設置為WB濾色孔)并照相。結果判斷：健康細胞的細胞核體積較大，發散均勻、微弱的淡綠色熒光；凋亡細胞的細胞核縮小、致密，發散高亮的綠色熒光。

光鏡下觀察和攝片，每組選10張，每張切片選20個視野，計算每20個放大100倍視野里胰腺凋亡陽性細胞數，分組匯總后計算其平均數。

2.3.4 MTS法檢測MIN6細胞增殖 消化細胞后吹打散細胞計數，調整細胞濃度1×105個/mL，分到96孔板，每孔100μL，即每孔細胞為1×104個。貼壁細胞需待細胞貼壁后收集各個時間點的細胞(0 h、24 h、48 h、72 h)，加入cell Titer96AQ單溶液細胞增殖檢測試劑(Promega，Cat.No.G3582)，比例為1/10，即100 μL培養液加入10 μL檢測液。孵育4 h后酶標儀讀板，MTS檢測讀取OD490數據。

2.3.5 流式細胞術檢測MIN6細胞凋亡 將細胞培養板各組的培養基分別轉移到15 mL 的錐形管中并置于冰上，用2 mL PBS 溶液輕輕潤洗培養板內細胞，去除PBS 溶液，加入0.5 ml 0.25%胰酶不含EDTA孵育，直到顯微鏡下觀察到細胞開始從培養板壁脫落，輕輕連續拍打使細胞從培養板壁上完全脫落，將細胞重懸于預冷的1×結合緩沖液中使其密度大約為1×106細胞/ml，將0.5 mL 細胞懸液從細胞培養板中(5×105個細胞)轉移到一個干凈的離心管內，加入1.25 μL Annexin V-FITC，室溫(18～24°C)避光反應15 min，室溫1000×g 離心5 min，去除上清，將細胞用0.5 mL 預冷的1×結合緩沖液輕輕重懸，加入10 μL Propidium Iodide，將樣本放置在冰上避光保存，立即用流式細胞儀檢測分析。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 治療后各組大鼠一般情況比較

表1示，正常組大鼠毛發自然有光澤，行動正常，無多飲、多食及多尿。糖尿病模型組大鼠毛發晦暗粗糙，行動偏遲緩，有多飲、多食、多尿癥狀。治療組大鼠上述癥狀有一定改善，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠治療后飲水、攝食及尿量水平比較

3.2 治療后各組大鼠血清FBG，FINS及IAI比較

表2示，模型組與正常組比較，FBG與FINS水平均升高(P<0.01)，IAI水平下降(P<0.01)；治療組與模型組比較，FBG與FINS水平均下降(P<0.01)，IAI水平升高(P<0.01)，差異均有統計學意義。

表2 治療后各組大鼠FBG、FINS、IAI水平比較

3.3 治療后各組大鼠血脂水平比較

表3示，模型組與正常組比較，TG與TC水平均升高(0.05，P<0.01)，HDL水平下降(P<0.01)，LDL水平也有下降，但與正常組比較差異無統計學意義；治療組與模型組比較，HDL水平明顯升高(P<0.01)，其余指標也有所改善，但差異無統計學意義。

表3 治療后各組大鼠血脂水平比較

3.4 各組大鼠病理檢測結果比較

3.4.1 各組大鼠胰腺組織病理比較 正常組大鼠胰島呈橢圓形，細胞形態飽滿，排列緊密，邊界清晰，結構規則，胞漿充實飽滿。模型組大鼠胰島萎縮，形態不規則，邊界不清晰，結構紊亂，胞漿疏松，有的存在空泡。治療組大鼠胰島形態基本規則，胰島與外分泌部界限較清晰，胞漿少量空泡(見圖1)。

注：A.正常組；B.糖尿病；模型組；C.治療組(箭頭所示為模型組典型改變)圖1 各組大鼠胰腺組織病理學結果比較(HE染色×40)

3.4.2 各組大鼠肝臟組織病理比較 正常組大鼠肝臟組織結構完整、清晰，肝小葉結構正常，肝細胞形態正常，肝索排列均勻規則，無壞死。糖尿病模型組大鼠肝小葉變形，界限不清晰，肝索排列紊亂，肝細胞腫脹變形，大小不均勻，可見局部壞死，細胞質中見大小不等的脂肪空泡。治療組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞形態基本正常，大小基本均勻，細胞質中脂肪空泡減少(見圖2)。

注：A.正常組；B.糖尿病；模型組；C.治療組(箭頭所示為模型組典型改變)圖2 各組大鼠肝臟組織病理學結果比較(HE染色×40)

3.4.3 各組大鼠肌肉組織病理比較 正常組大鼠肌纖維排列規則，肌間隙均勻一致，無肌纖維扭曲、斷裂、溶解和壞死現象。糖尿病模型組肌大鼠肌纖維排列紊亂、斷裂、扭曲，肌間隙大小不一。治療組大鼠肌纖維較模型組排列規則，無明顯斷裂扭曲，肌間隙均勻(見圖3)。

注：A.正常組；B.糖尿病模型組；C.治療組(箭頭所示為模型組典型改變)圖3 各組大鼠肌肉組織病理學結果比較(HE染色×40)

3.4.4 各組大鼠脂肪組織病理比較 正常組大鼠脂肪細胞結構清晰、分界清楚呈蜂窩狀。糖尿病模型組大鼠脂肪細胞體積明顯增大，輪廓變形。治療組大鼠脂肪組織細胞體積較模型組減小，輪廓清晰(見圖4)。

注：A.正常組；B.糖尿病模型組；C.治療組(箭頭所示為模型組典型改變)圖4 各組大鼠脂肪組織病理學結果比較(HE染色×40)

3.5 各組大鼠胰腺β細胞凋亡比較

細胞在發生凋亡時會激活一些DNA內切酶，DNA斷裂暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶的催化下加上熒光素標記的dUTP，TUNEL檢測呈現藍色[4-6]。凋亡細胞的細胞核在DAPI檢測中呈現高亮的綠色熒光。

表4圖5示，正常組、模型組、治療組均有藍色熒光，表明實驗結果有效。與正常組比較，糖尿病模型組藍色熒光區域明顯增加，并可見綠色散在熒光，TUNEL、TUNEL/DAPI值顯著升高(P<0.01)，提示胰腺β細胞凋亡增加；治療組藍色熒光較糖尿病模型組減少，偶見綠色熒光，TUNEL、TUNEL/DAPI值低于模型組(P<0.01)，差異有統計學意義，表明固本暢樞方能有效抑制糖尿病模型大鼠胰腺β細胞的凋亡。

表4 治療后各組大鼠胰腺TUNEL/DAPI檢測結果比較

注：A.正常組；B.糖尿病；模型組；C.治療組(箭頭所示為凋亡細胞)圖5 TUNEL染色與DAPI染色重疊拍照(40×10)

3.6 各組MIN6細胞增殖比較

圖6示，細胞形態觀察顯示，凋亡模型組細胞數量明顯減少，細胞體積變小，細胞間隙增大，細胞核固縮；含藥血清組(干預48 h)細胞形態較模型組有不同程度的改善。圖7示，MTS法檢測細胞增殖，0 h各組MIN6細胞藥物敏感性無差異，干預12 h、24 h、48 h后，凋亡模型組MIN6細胞藥物敏感性明顯下降，含藥血清組在24 h、48 h有不同程度上升。

注：A.正常組；B.凋亡模型組；C.含藥血清組(箭頭所示為凋亡細胞)圖6 各組MIN6細胞干預48 h形態學觀察比較(10×10)

圖7 MIN6細胞藥物敏感性MTS檢測

3.7 各組MIN6細胞凋亡比較

Annexin V被公認為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進行綠色熒光(fluorescein isothioc yanate, FITC)標記，以標記的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶(propidium iodide, PI)是一種核酸染料，不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整細胞膜，但對凋亡中晚期細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜染紅細胞核。因此將Annexin V與PI匹配使用，可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。

圖8示，在雙變量流式細胞儀的散點圖上，Q4象限顯示活細胞，Q3象限為早期凋亡細胞，Q2象限為凋亡晚期細胞和壞死細胞。結果提示，模型組Q2+Q3象限細胞數顯著升高，含藥血清干預組Q2+Q3象限細胞數較模型組少(29 vs. 14.05)，提示固本暢樞方含藥血清可以改善MIN6細胞早期及晚期凋亡。

注：A.正常組；B.凋亡模型組；C.含藥血清組(箭頭所示為凋亡細胞象限)圖8 各組MIN6細胞凋亡比較

4 討論

糖尿病屬于中醫學“消渴”范疇。既往課題組經過長期臨床實踐發現，脾腎陽氣虛損在糖尿病發病過程中有重要作用，即陽氣易虛、陽虛致消、樞機不利、陽氣失用、痰飲、瘀血等病理產物亦是由于正虛、陽氣的運行障礙所致[4]。因此，從正氣虧虛、脾腎陽(氣)不足在疾病發生發展中所起的主導作用入手，提出陽虛樞機不利為肥胖2型糖尿病的基本病機。治療以固本暢樞為法，方擬茯苓四逆湯、施今墨降糖對藥方合小柴胡湯加減進行臨床研究，組方中附子、干姜、黃芪溫腎助陽，重在激發先天之原動力，使其蒸騰氣化津液到達全身臟腑組織；葛根、黃芩生津止渴，口干口渴諸癥緩解以免精微物質外流；黨參、茯苓、山藥、大棗、蒼術健脾益氣，培補后天之本，使水谷精微得以四布、臟腑得養、濕濁得化、精微得布；法半夏、丹參、柴胡樞暢氣機，運血周流全身，以免瘀血形成。前期研究顯示，固本暢樞方能降低肥胖糖尿病患者血糖血脂，改善IR，減輕口干、多飲、多尿及乏力等臨床癥狀[3]。組方的主要中藥藥理學研究發現，黃芪化合物可以改善胰島素抵抗，減輕糖耐量異常[5-6]；葛根中的葛根素能通過提高葡萄糖的利用率，改善葡萄糖耐量并降低血糖[7-8]；山藥多糖能顯著降低2型糖尿病大鼠空腹血糖，其降血糖作用與二甲雙胍相當[9]；茯苓粗提物具有類似于二甲雙胍改善外周胰島素抵抗的作用[10]；丹參可以降低糖尿病模型大鼠血糖水平[11]，其有效成分丹酚酸A以劑量依賴的方式增加葡萄糖的消耗和攝取[12]。中藥復方相互協同，以不同方式發揮降糖作用。

研究表明，T2DM患者體內的胰島β細胞損傷呈進行性加重，這可能與糖脂代謝紊亂、氧化應激、炎癥反應等有關[13-14]。胰島β細胞凋亡過多會造成胰島β細胞功能障礙，因此改善T2DM患者體內糖脂代謝環境、抑制胰島β細胞凋亡對防治2型糖尿病有重要意義。臨床實踐中暫未發現可以同時改善糖脂代謝紊亂及胰島β細胞凋亡的藥物，所以本研究未設陽性對照藥物組。本研究提示，糖脂代謝紊亂肥胖大鼠模型可通過長期高脂高糖飲食+小劑量STZ腹腔注射誘導成功，長期高脂高糖飲食可導致大鼠體質量增加、胰島素抵抗及糖耐量減低，小劑量STZ可引起胰島β細胞破壞，其病理生理改變符合肥胖2型糖尿病的胰島素抵抗及胰島β細胞功能缺陷兩大特點[15]。糖尿病模型組大鼠的飲水、攝食、尿量明顯增加，伴隨高血糖、高脂血癥、空腹胰島素水平升高，胰島素敏感性下降，而經固本暢樞法治療后以上癥狀均能得到不同程度改善，體現了該治法降低血糖血脂、改善胰島素抵抗的綜合調節作用。組織HE染色觀察提示，治療組大鼠的組織病理學表現得到一定程度的修復，有利于胰島β細胞功能恢復，進一步促進胰島素分泌，減少肝糖原的輸出，增加肌肉、脂肪組織對胰島素的敏感性，從而起到降低血糖的作用。

細胞凋亡是一種活躍的細胞死亡模式，在多細胞生物的發育過程中發揮著重要作用[16]。大量的DNA雙鏈斷裂被認為是凋亡中最顯著的特征[17]。但是TUNEL染色的局限使凋亡細胞和壞死細胞無法區分，其特異性降低，假陽性增加。故結合DAPI染色能準確反映細胞核中的DNA斷裂及染色定位，陽性細胞和陰性細胞對比顏色鮮明，容易辨認[18]。本研究發現，糖尿病模型組可見明亮的藍色及綠色熒光，TUNEL、TUNEL/DAPI值顯著升高，提示胰腺β細胞凋亡增加；治療組藍色熒光比糖尿病模型組少，偶見綠色熒光，TUNEL、TUNEL/DAPI值低于模型組，提示固本暢樞方能有效抑制糖尿病模型大鼠胰島β細胞的凋亡。體外實驗結果提示，固本暢樞方含藥血清可以改善MIN6細胞凋亡模型組的細胞形態，干預24 h及48 h后含藥血清組MIN6細胞的敏感性有所提升；流式細胞術檢測提示，固本暢樞方含藥血清能夠減少MIN6細胞凋亡模型的早晚期凋亡細胞及壞死細胞的數量。本研究應用2種方法相結合檢測細胞凋亡，其結果更準確。

綜上，固本暢樞法能夠改善肥胖糖尿病模型大鼠糖脂代謝紊亂，其作用機制與修復胰腺、肝臟、肌肉及脂肪組織的病理形態、抑制胰島β細胞凋亡有關。