小檗堿通過抑制Th1恢復IFN-γ/IL-4平衡減輕遲發型超敏反應*

陶文婷，陳姣姣，高清華，翟 毅，李蔚華△

(1. 湖北中醫藥大學基礎醫學院，武漢 430065； 2. 華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院，武漢 430077)

遲發型超敏反應(delayed type hypersensitivity, DTH)是公共健康面臨的重要挑戰之一。據統計，全世界約有15%～20%的人患有此種疾病[1]。DTH發生較慢，通常在接觸相同抗原24～72 h后出現炎癥反應[2]，是一種由特異性T細胞介導的細胞免疫應答，其主要效應細胞是CD4+Th1細胞[3]，臨床特征主要為單核細胞浸潤和組織損傷。

小檗堿是從傳統中藥黃連和黃柏中提取出來的異喹啉類生物堿[4]，具有多種藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、降血糖、調血脂、保護新血管以及免疫抑制等[5-7]。在動脈粥樣硬化中，小檗堿能夠抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路，阻礙NF-kappa-B inhibitor alpha(IkB-α)磷酸化和p65蛋白核轉位，發揮抗炎作用[8]；在潰瘍性結腸炎中，小檗堿活化信號傳導因子和轉錄激活因子(signal transducing activator of transcription，STAT)1和STAT3降低Th17和Th1細胞分化，抑制白介素-17(interleukin-17，IL-17)及γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)分泌發揮抗炎作用[9-10]。有研究表明，在類風濕性關節炎中，小檗堿可通過下調p-ERK、p-P38和p-JNK表達發揮抗炎作用，減少炎癥細胞浸潤，改善關節組織破壞情況[11]。同時小檗堿具有免疫毒性，在DTH中發揮免疫抑制作用，但其具體機制不明[12]。本研究使用小檗堿作用于遲發型超敏反應小鼠，觀察其抗炎效應并探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級32只雌性C57BL/6小鼠，體質量18～20 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號SCXK(遼)2015-0001。在室溫(20 ± 2)℃，12 h光照，自由飲食環境適應性喂養1周。本實驗已通過湖北中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查(倫理學批號HUCMS2018101102)。

1.2 藥品與試劑

小檗堿(貨號B3251)、12.5%EDTA(貨號D2900000)、卵清蛋白(ovalbumin, OVA，貨號O1641)、弗氏完全佐劑(貨號F5881)、刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A，貨號L7647)等購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養基(貨號21870100)、胎牛血清(貨號10099133C)、抗生素(5000 μ/mL鏈霉素和青霉素，貨號15070063，購自美國Gibco公司；小鼠淋巴細胞分離液(貨號7200100)，購自中國達科為公司；γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ，貨號25712)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α，貨號24835)和白介素-4(interleukin-4，IL-4)(貨號287287)酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒，購自中國欣博盛公司。

1.3 主要儀器

冰凍切片機(CM1860UV，德國Leica公司)；倒置顯微鏡(BX40F4，日本尼康公司)；離心機(FC5515R，美國OHAUS)；CO2培養箱(MCO-18 A型，日本松下公司)；酶標分析儀(DNM-9602，北京普朗新技術有限公司)。

2 方法

2.1 造模與分組

動物按照隨機數字表法分為對照組、DTH組、小檗堿組、DTH+小檗堿組4組各8只，隨機編號稱重。DTH組在第1天皮下注射致敏劑(將50μg OVA 溶于50 μL生理鹽水中，然后用50 μL完全弗氏佐劑乳化)，第8天于左足墊注射激發劑(將200μg 熱聚OVA溶解于20 μL的PBS中)，右足墊注射等體積的PBS作為對照，24 h后頸椎脫臼處死取材。小檗堿組第2天至第8天腹腔注射小檗堿(10 mg/(kg·d)溶于0.05%DMSO(圖1)，對照組僅腹腔注射等量0.05%DMSO。

圖1 造模示意圖

2.2 觀察指標與方法

2.2.1 小鼠足墊厚度測量 游標卡尺測量小鼠雙后肢足墊厚度，足墊腫脹程度=OVA注射側足墊厚度-PBS注射側足墊厚度。

2.2.2 HE染色 分離足墊組織，常規制片，用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)進行染色，鏡下觀察并進行炎性細胞計數。隨機選取5個視野(×400)，對視野中的淋巴細胞及單核細胞進行計數，最后取平均值。

2.2.3 ELISA檢測 將足墊進行組織勻漿，離心后取上清，用ELISA試劑盒檢測IFN-γ、 TNF-α和IL-4水平，按照試劑盒說明書進行檢測。

2.2.4 脾臟單個核細胞制備 取脾臟組織置于培養皿中，加入淋巴細胞分離液分離脾臟組織，將樣本轉移至15 ml離心管中，并覆蓋500 μL RPMI 1640培養基，室溫下800 g離心30 min，吸取第2層環狀乳白色液體(淋巴細胞層)于另1個干凈離心管中，加入5 ml紅細胞裂解液，4 ℃靜置5 min后加入PBS 5 ml，350 g離心5 min，洗滌1～2次，最后沉積于試管底部的即為淋巴細胞。加入RPMI 1640培養基(含10%胎牛血清及100 U/mL鏈霉素和青霉素)重懸細胞并接種于培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養箱孵育過夜，次日取未貼壁細胞為脾臟單個核細胞，臺盼藍染色并進行細胞計數，調整濃度1×106個/mL。

2.2.5 ConA刺激實驗 將2 mg Con A溶于100 μL RPMI 1640培養基中，然后用培養基稀釋至5μg/mL。取不同組的脾臟單個核細胞懸液100 μL到96孔細胞培養板中，再分別加入100 μL ConA稀釋液，置于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育72 h，收集上清，ELISA法檢測IFN-γ水平。

2.2.6 OVA致敏檢測 從DTH組小鼠獲得的脾臟單個核細胞懸液接種至 96孔培養板中，2×106/孔，設置空白對照組、OVA組和0.1、1、10 μM濃度的小檗堿組。將培養基置于37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育72 h，收集上清，用ELISA檢測IFN-γ、IL-4水平。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 小檗堿抑制OVA誘導DTH

表1、2示，DTH模型小鼠足墊腫脹明顯，低[0.1 mg/(kg·d)]、中[1 mg/(kg·d)]劑量小檗堿處理無明顯影響。當小檗堿濃度為10 mg/(kg·d)時，足墊腫脹程度明顯減輕(P<0.001)，故后續實驗使用小檗堿濃度為10 mg/(kg·d)。用OVA誘導DTH，DTH組的足墊明顯腫脹(P<0.001)與之比較，DTH+小檗堿組腫脹程度明顯減輕(P<0.001)。

表1 不同劑量小檗堿對DTH小鼠足墊腫脹的影響

表2 各組足墊組織增長的厚度比較

3.2 小檗堿減少DTH小鼠足墊組織炎性細胞浸潤

表3示，HE染色與DTH組比較，DTH+小檗堿組炎性細胞浸潤數目顯著減少(P<0.001)，提示小檗堿可抑制足墊組織炎癥細胞浸潤，改善小鼠足墊炎癥情況。

表3 各足墊組織炎性細胞數目比較(個

3.3 小檗堿減輕DTH炎癥因子釋放

表4示，ELISA檢測顯示，與DTH組比較DTH+小檗堿組足墊組織中的IFN-γ、TNF-α水平明顯減少(P<0.001)，而兩者IL-4水平比較差異無統計學意義。

表4 足墊組織炎性因子水平比較

3.4 小檗堿抑制Th1反應

表4示，分離小鼠脾臟單個核細胞并體外培養，給予ConA刺激，DTH組IFN-γ分泌明顯增加。與DTH比較，DTH+小檗堿組分泌的IFN-γ明顯減少(P<0.01)，結果提示小檗堿處理能夠抑制Th1反應，其效應與抗炎作用相關。

表5 ConA檢測各組脾臟單個核細胞中IFN-γ水平比較

3.5 小檗堿恢復IFN-γ/IL-4平衡

表6示，OVA致敏實驗顯示，小檗堿處理抑制IFN-γ分泌，其效應與濃度正相關，但對IL-4無明顯影響，最終使IFN-γ/IL-4比例明顯下降并恢復平衡。

表6 小檗堿對脾臟單個核細胞IFN-γ和IL-4的影響比較

4 討論

本實驗使用OVA誘導的DTH模型，其致敏過程在相對較短時間內就能完成，廣泛應用于藥物免疫調節和抗炎作用的研究[13]。該模型的建立分為2個階段：在致敏階段，OVA誘導區域淋巴結中T淋巴細胞的活化和增殖；在效應階段，OVA再刺激引發T淋巴細胞和巨噬細胞募集至攻擊部位，產生多種炎癥介質并增強DTH的炎癥反應[14]。本研究發現，與對照組比較DTH組足墊厚度明顯增加，炎性細胞數目增多，且炎癥因子表達顯著增加；脾臟單個核細胞中IFN-γ分泌增多，DTH組發生Th1極化，產生炎癥反應。

根據細胞因子環境的不同，可以使Th0細胞向Th1、Th2轉化或Th1細胞與Th2細胞之間發生轉化[15]。Th1細胞主要分泌促炎性細胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-1β，而Th2細胞則主要分泌抗炎性細胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-6和IL-13[16]。其中IL-4對Th0細胞分化為Th1和Th2起關鍵性調控作用。IL-4在高水平時Th0細胞主要分化為Th2細胞， IL-4缺乏時IFN-γ能夠促進Th0細胞分化為Th1細胞。此外，Th1分泌的IFN-γ和Th2分泌的IL-4，不僅可以促進自身分泌細胞的成熟，還可以抑制對方的分化[15]。當機體處于正常狀態時，Th1/Th2細胞處于平衡狀態，故IFN-γ/IL-4平衡一定程度上能夠反映Th1/Th2平衡狀態。在本研究中DTH組發生了Th1極化，炎性細胞因子分泌增加，小檗堿處理則抑制Th1反應，表現為足墊組織炎性因子IFN-γ、TNF-α減少，脾臟單個核細胞ConA刺激實驗IFN-γ分泌降低，小檗堿能夠降低OVA刺激脾臟單個核細胞IFN-γ的分泌水平，而對IL-4無明顯影響。

總而言之，小檗堿在OVA誘導的DTH模型中發揮抗炎作用，其可能的作用機制是小檗堿抑制Th1細胞介導的免疫反應，使 Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)平衡恢復，從而減緩DTH炎癥反應。然而是否存在其他相關反應及作用機制，有待進一步實驗探討。