甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14介導(dǎo)長鏈非編碼RNA EIF3J反義RNA1對膽管癌細胞遷移和侵襲的影響

歐陽柳 鄭浩 程文英 陶元平 李慧芬 李小玲 張雷 李勃 郭世偉 胡先貴 金鋼

1海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院普外三科，上海 200433；2海軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院肝外三科，上海 200433；392493部隊醫(yī)院內(nèi)三科，葫蘆島 125003；4海軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院介入科，上海 200433；592493部隊醫(yī)院門診部，葫蘆島 125003

膽管癌根據(jù)膽管的解剖位置可分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌，通常確診晚，常伴有腫瘤血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后較差[1-3]，患者的5年生存率只有20%～30%[4]。目前為止，膽管癌發(fā)生和進展的確切分子機制尚不完全清楚。RNA表觀遺傳修飾是RNA調(diào)節(jié)基因表達的化學基礎(chǔ)，N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物信使RNA(messenger RNA, mRNA)中含量最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾之一，約占總修飾的50%[5]，其修飾的生成依賴于甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase-like protein 14，METTL14)。METTL14是m6A甲基化修飾酶的重要編碼器，在多種腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用[6]。研究表明，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡調(diào)控中也起著關(guān)鍵作用[7-10]。lncRNA EIF3J反義RNA1(antisense RNA1，EIF3J-AS1)首次報道在肝細胞癌腫瘤樣本中顯著上調(diào)[11]，并且其表達異常與食管癌和結(jié)腸癌等的發(fā)生與進展密切相關(guān)[12-13]。通過在線數(shù)據(jù)庫GEPIA(http://gepia.cancerpku.cn/)證實METTL14與lncRNA EIF3J-AS1(lnc EIF3J-AS1)在膽管腫瘤組織中表達呈正相關(guān)，但METTL14是否直接介導(dǎo)lnc EIF3J-AS1在膽管癌腫瘤中異常表達，從而促進膽管癌的發(fā)生仍尚未完全明確。本研究擬探討METTL14介導(dǎo)lnc EIF3J-AS1促進膽管癌進展的潛在分子機制。

材料與方法

一、膽管癌組織METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表達檢測

收集2017年9月至2018年12月間海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院普外三科行手術(shù)切除并經(jīng)病理學證實的10例原發(fā)性膽管癌患者的癌組織和對應(yīng)的癌旁正常組織(距離腫瘤組織邊緣>2 cm)，其中男性9例，女性1例，年齡(52±8)歲。所有樣本離體后即刻置液氮冷凍，于-80℃冰箱保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

應(yīng)用Trizol法抽提膽管癌組織及癌旁組織總RNA,采用RNA逆轉(zhuǎn)錄與擴增試劑盒(日本TaKaRa公司)轉(zhuǎn)錄cDNA，再用GreenTMTB Premix Ex TaqTM(T1iRnaseH P1us，日本TaKaRa公司)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，按試劑盒說明書操作，以GAPDH為內(nèi)參。METTL14正向引物序列為5′-ACTTGCTGGGTACAAGTA-3′，反向引物序列為5′-CCTTCTGATGCTTGTCTGTT-3′；lnc EIF3J-AS1正向引物序列為5′-GTCAGATTTTGTCCGTTCA-3′，反向引物序列為5′-CATGGACTTGACGTAGCTGTT-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物序列為5′-GGAGTTACTTCTATGCCTGA-3′，反向引物序列為5′-TTCATGGGGAGGTACAAC-3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，共40個循環(huán)。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，應(yīng)用 2-△△CT公式計算METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1的相對表達量，每個樣品設(shè)3個復(fù)管，取均值。

二、膽管癌組織METTL14蛋白表達檢測

采用人蛋白裂解液(美國Roche公司)裂解膽管癌組織及癌旁組織，抽提總蛋白，應(yīng)用BCA法定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測METTL14蛋白表達，以actin為內(nèi)參。抗METTL14抗體(1∶1 000)購自英國Abcam公司(ab220030)，HRP二抗(1∶3 000)購自武漢博士德生物科技有限公司。最后ECL發(fā)光， X片曝光、顯影、定影。用Image J軟件掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

三、膽管癌HUCCT1和RBE細胞METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表達檢測

膽管癌細胞株HUCCT1和RBE均取自中國上海科學院細胞庫，常規(guī)復(fù)蘇及培養(yǎng)傳代。取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，分為HUCCT1對照組和HUCCT-METTL14組，RBE對照組和RBE-METTL14組。兩對照組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的陰性對照的慢病毒，兩METTL14組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的干擾METTL14表達的慢病毒。所有慢病毒均購自上海吉瑪生物制藥有限公司。慢病毒轉(zhuǎn)染按慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。取上述4組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的對數(shù)生長期細胞，按前述的實時熒光定量PCR檢測各組細胞METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表達量。

四、膽管癌HUCCT1和RBE細胞遷移和侵襲能力檢測

同上法將膽管癌細胞株分為HUCCT1對照組和HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組，RBE對照組和RBE-lnc EIF3J-AS1組。兩對照組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的陰性對照慢病毒，兩lnc EIF3J-AS1組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的干擾lnc EIF3J-AS1表達的慢病毒。應(yīng)用Transwell小室(美國Corning公司)實驗檢測細胞遷移能力。將Transwell小室隔膜上面用凝膠覆蓋后檢測細胞侵襲能力。將含1×105個細胞的100 μl無血清培養(yǎng)液加入Transwell小室的上室，下室加入含有10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液500 μl，培養(yǎng)24 h后取出小室隔膜，用棉簽輕輕擦去隔膜上面未穿膜的細胞，用4%多聚甲醛室溫固定隔膜30 min，PBS洗3次，1.5%亞甲藍染色，室溫干燥，在顯微鏡下觀察5個高倍鏡視野，計算每個視野的穿膜細胞數(shù)，取均值。

五、膽管癌HUCCT1和RBE細胞EGFR和AKT蛋白表達檢測

收集HUCCT1對照組、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組、RBE對照組、RBE-lnc EIF3J-AS1組對數(shù)生長期細胞，裂解提取細胞總蛋白，按前述的蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表達，以actin為內(nèi)參。抗EGFR抗體(1∶1 000，ab52894)、p-AKT 抗體(1∶2 000，ab38449)、AKT抗體(1∶2 000，ab8805)均購自英國Abcam公司，HRP二抗(1∶3 000)購自武漢博士德生物科技有限公司。p-AKT、AKT蛋白表達以兩者的比值表示。

六、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、膽管癌組織和癌旁組織METTL14、lnc EIF3J-AS1表達水平及其相關(guān)性

膽管癌組織及其癌旁正常組織METTL14 mRNA表達量分別為0.075±0.012和0.031±0.006，lnc EIF3J-AS1表達量分別為0.140±0.032和0.064±0.012，癌組織表達量均顯著高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為9.85、10.79，P值均<0.05)。膽管癌組織METTL14 mRNA與lnc EIF3J-AS1表達水平呈正相關(guān)(r=0.883，P=0.0007，圖1)。

圖1 10例膽管癌組織METTL14 mRNA與lnc EIF3J-AS1表達的相關(guān)性

膽管癌組織及其癌旁正常組織METTL14蛋白表達量分別為0.354±0.131和0.187±0.183，癌組織顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=13.51，P=0.008，圖2)。

圖2 10例膽管癌組織和癌旁正常組織METTL14蛋白表達水平

二、抑制膽管癌細胞METTL14 mRNA表達對lnc EIF3J-AS1表達的影響

HUCCT1-METTL14組細胞METTL14 mRNA表達水平顯著低于對照組(0.109±0.023比1.000±0.035)，RBE-METTL14組METTL14 mRNA表達水平也顯著低于對照組(0.137±0.011比1.000±0.019 )，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為8.91、12.51，P值均<0.05)。表明敲減METTL14的HUCCT1和RBE細胞株構(gòu)建成功。

HUCCT1-METTL14組細胞lnc EIF3J-AS1表達水平顯著低于對照組(0.217±0.020比1.000±0.052)，RBE-METTL14組lnc EIF3J-AS1表達水平也顯著低于對照組(0.149±0.066比1.000±0.045)，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為8.02、11.23，P值均<0.05)。提示抑制膽管癌細胞METTL14表達可下調(diào)lnc EIF3J-AS1的表達。

三、下調(diào)lnc EIF3J-AS1表達對膽管癌細胞遷移和侵襲能力的影響

HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組細胞lnc EIF3J-AS1表達水平顯著低于對照組(0.123±0.045比1.000±0.011)，RBE-lnc EIF3J-AS1組lnc EIF3J-AS1表達水平也顯著低于對照組(0.108±0.059比1.000±0.029)，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為10.22、11.21，P值均<0.05)。表明敲減lnc EIF3J-AS1的HUCCT1和RBE細胞株構(gòu)建成功。

細胞遷移實驗結(jié)果顯示，HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組細胞的遷移和侵襲能力均較對照組顯著下降(每高倍視野穿膜細胞數(shù)20.33±0.67比70.67±0.33，5.00±0.58比23.33±0.33)，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為12.23、11.59，P值均<0.05，圖3)；RBE-lnc EIF3J-AS1組細胞遷移和侵襲能力也均較對照組顯著下降(每高倍視野穿膜細胞數(shù)12.00±0.58比25.00±2.52，22.33±0.89比43.67±0.33)，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為15.12、8.66，P值均<0.05，圖3)。提示下調(diào)膽管癌細胞lnc EIF3J-AS1表達可抑制其遷移和侵襲能力。

四、下調(diào)lnc EIF3J-AS1表達對膽管癌細胞EGFR-AKT信號通路的影響

HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組EGFR蛋白表達水平和p-AKT/AKT比值均較對照組顯著降低(0.109±0.015比1.000±0.018，0.226±0.036比1.000±0.051，圖4)，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為8.56、12.77，P值均<0.05)。RBE-lnc EIF3J-AS1組EGFR蛋白表達水平和p-AKT/AKT比值也均較對照組顯著降低(0.118±0.052比1.000±0.069，0.132±0.098比1.000±0.023，圖4)，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為10.81、12.21，P值均<0.05)。提示下調(diào)膽管癌細胞lnc EIF3J-AS1可抑制其EGFR蛋白表達，抑制AKT蛋白的磷酸化。

圖3 HUCCT1對照組、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組、RBE對照組、RBE-lnc EIF3J-AS1組的遷移(3A～3D)和侵襲(3E～3H)能力(亞甲藍染色 ×400)

圖4 HUCCT1對照組(1)、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1組(2)、RBE對照組(3)、RBE-lnc EIF3J-AS1組(4)膽管癌細胞EGFR、p-AKT、AKT蛋白表達

討 論

m6A修飾是真核RNA中最常見的化學標記，是一種可逆的表觀調(diào)控修飾[14]。這種修飾被發(fā)現(xiàn)于嵌入RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共識序列G(G>A)m6AC(U>A>C)中的腺苷，特別是在終止密碼子附近[15]。越來越多的證據(jù)表明，RNA中的m6A修飾影響RNA的穩(wěn)定性和功能，并對大多數(shù)生物過程至關(guān)重要，包括組織發(fā)育、DNA損傷反應(yīng)、性別決定和腫瘤發(fā)生等[16]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物由METTL3、METTL4、METTL14、WTAP、VIRMA等組成[17]。近期研究表明，甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL4在多種實體惡性腫瘤的發(fā)生及進展中發(fā)揮著重要作用，然而METTL14在膽管癌的發(fā)生和進展中的作用在很大程度上尚不清楚[18]。本研究通過定量PCR以及蛋白免疫印跡實驗證實m6A甲基化酶METTL14在膽管癌腫瘤組織中上調(diào)表達，提示METTL14可能在膽管癌的發(fā)生和進展中扮演重要的癌基因角色。

lnc RNA在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色，其中l(wèi)nc EIF3J-AS1首次報道在肝細胞癌腫瘤樣本中顯著上調(diào)，并與肝細胞癌的無復(fù)發(fā)生存密切相關(guān)[11]。然而，其對膽管癌細胞惡性行為的潛在生物學作用尚未見報道，且是否受到m6A調(diào)控尚未明確。本研究證實lnc EIF3J-AS1在膽管癌腫瘤組織中表達上調(diào)，并且與METTL14呈正相關(guān)，抑制METTL14表達可下調(diào)lnc EIF3J-AS1在膽管癌細胞中的表達水平。進一步實驗證實下調(diào)lnc EIF3J-AS1可抑制膽管癌細胞遷移和侵襲能力，并抑制EGFR蛋白表達和Akt蛋白的磷酸化，提示METTL14可能通過上調(diào)lnc EIF3J-AS1表達在膽管癌細胞惡性行為中和EGFR-Akt信號通路調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

綜上所述， m6A甲基化酶METTL14介導(dǎo)lnc EIF3J-AS1上調(diào)表達可以促進膽管癌細胞的侵襲和遷移能力，但本研究的隊列樣本量少，未來仍需擴大樣本量進一步驗證METTL14與lnc EIF3J-AS1在膽管癌組織和細胞中的表達情況，以及與膽管癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突