褪黑素對玉米幼苗根系發育和抗旱性的影響

馬旭輝 陳茹梅 柳小慶 趙軍 張霞

（中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

玉米是我國第一大糧食作物，2019 年種植面積達4.13×108hm2，總產量達2.61×108t，種植面積和總產量均位居全球第二，僅次于美國。我國玉米增產對整個糧食作物增產的貢獻率達到將近60%，居糧食作物之首，在我國國民經濟發展中占有舉足輕重的地位，因此玉米的穩產和高產是保障國家糧食安全及相關產業發展的基礎。玉米是一種對水分敏感的作物，在生長發育過程中對水的需求都比較大，苗期干旱會造成玉米營養生長緩慢，花期干旱會影響花器官的分化和生長，導致散粉和吐絲間隔延長，造成嚴重的產量損失。在過去25 年里，干旱使全球玉米產量減少40%左右［1］。在水資源匱乏，氣候變化加劇，耕地面積不斷減少的大環境下，為保證玉米穩產和高產，必須采取多種措施提高玉米作物抗旱性。目前提高農作物的抗旱性主要采取兩種方式，一是加強土壤管理，通過引水澆灌，秸稈還田，深耕土壤等方式；二是通過常規的雜交育種和基因工程手段培育優良的抗旱品種。目前出現了新的方式提高植物對干旱脅迫的耐受力，即使用一些化學制劑（包括亞硝基氰化鈉，過氧化氫，硫氫化鈉，多胺，褪黑素等）可以提高植物對不同非生物脅迫的耐受力，改善細胞內穩態和植物生長，這些化學試劑被稱為誘發劑（Priming）［2］。因此，尋找合適的植物誘發劑來提高作物的抗旱性是提高作物產量的有效途徑之一。

褪黑素，化學名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺（N-acetyl-5-methoxy-tryptamine），是一種吲哚色胺。1958 年，Lerner 等［3］首次從牛的松果體中提取出褪黑素，隨后，研究人員陸續在不同的生物體中發現褪黑素的存在，且Tan 等［4］從藻類中分離并鑒定出了褪黑素，證實了植物界中也存在有褪黑素，表明了褪黑素廣泛存在于生物體內。據報道，褪黑素參與動物的生長、發育調控和信號轉導，在調節植物生長發育方面也起著關鍵作用，包括營養生長、種子萌發、生根和開花等過程［5-6］。由于褪黑素參與了許多植物的發育過程和逆境反應。2018 年，Kanwar 等［7］對褪黑素在光合作用中的作用、脅迫下的植物激素相互作用、細胞氧化還原信號以及在植物免疫、植物修復和植物微生物相互作用中的其他調節作用進行了全面綜述，認為雖然植物褪黑素是一種獨立的植物生長調節劑，可以與其他植物生長調節劑或激素相互作用，但它是否可以作為一種完整的植物激素，目前仍有待確定［7］。

根系，作為“承上啟下”的主要營養器官，發揮著固持植物體地上組織和汲取地下水分和養分的雙重功能，在植物整個生長發育過程中發揮著重要的作用。同時，植物根系也是感知土壤水分匱缺的第一“信使”，能夠將土壤水分及養分的信息快速傳遞到地上部分，使地上組織作出反應，參與植物應對干旱脅迫反應［8］。根系的構型，特指植物根群組成的具有生物功能的復雜的根系空間結構和形態，即各級根軸之間精細的空間擴展方式［9］。根系構型包括根體積、根長、根直徑、根總重、根冠比等，主要由遺傳因素決定，同時受土壤介質環境、種植密度、植株大小和農業耕作等因素影響。它可以決定植物對水分和營養的吸收，從而影響植物地上部分的生長和抗旱性，對于維持植物在干旱條件下的產量也十分重要。玉米根系屬于須根系，按照根系類型建成的發育階段可以將玉米根系分成：種子萌發時形成的的種子根（Seminal root）或主根（Primary roots）、莖生的節根（Crown roots）和氣生根（Brace roots）以及著生于這些根上的側生根（Lateral roots）［10］。其中主根形成于胚根鞘，種子根形成于中胚軸盾片，且主根會在玉米生長后期發生退化。初生根系、次生根系和氣生根系交錯分布，共同構成玉米強大而密集的根系系統。玉米在水分脅迫下，根系構型、內部細胞結構、細胞內滲調物質的積累會發生一系列適應性改變，如改變根重和側根數量、根冠比加大，從而影響地上植株的生長發育，最終影響玉米產量。研究表明，外源添加500 μmol/L褪黑素可以顯著促進黃瓜側根的生長［11］。Zhang等［12］通過GO 和通路富集分析（Pathway enrichment analysis）發現褪黑素促進黃瓜側根發育的主要作用機制是激活根系中相關激素和轉錄因子通路，減少根系發育過程中因呼吸作用產生的ROS 損傷。這些研究結果表明褪黑素可以促進一些植物根系的發育，但是褪黑素促進根系發育的具體機制目前還不清楚。

褪黑素已被證明可以增強植物的非生物脅迫能力，包括干旱脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、鹽脅迫、重金屬脅迫等［13-16］。Zhang 等［17］詳細的介紹了植物在惡劣環境條件下褪黑激素的調節作用。環境脅迫可以增加植物內源性褪黑激素的水平。褪黑激素生物合成基因的過表達可以提高轉基因植物的褪黑素水平，且這些轉基因植物對非生物脅迫表現出更強的耐受性。同時外源褪黑素的施加也能提高植物對非生物脅迫的耐受能力。褪黑素介導基因RsMT1（Metallothionein 1）的上調，增強煙草植物對Cd 的耐受性［18］。Yang 等［19］通過轉錄組分析表明，外源褪黑素主要通過調控參與光合作用、ROS 代謝、類黃酮和褪黑激素生物合成的基因來增強抗氧化保護，提高橡樹（Hevea brasiliensis）耐鹽脅迫能力。Zhang等研究發現在干旱脅迫條件下，經褪黑素處理的黃瓜（Cucumis sativusL.）植株種子萌發率和根系生長率較高［11］，褪黑素還能改善葡萄插穗時的干旱脅迫［20］。在擬南芥中過表達褪黑素受體（AtPMTR1），導致氣孔關閉，提高水分利用效率和耐旱性［21］。雖然已有多項研究表明，使用褪黑素可以提高作物的抗旱性，但對其提高農作物抗旱性的具體作用機制卻知之甚少。

因此，本研究采取根灌褪黑素和褪黑素浸種兩種外源施用方法，通過萌發紙水培培養和土培盆栽的兩種種植方法，探索PEG 誘導的干旱脅迫和土壤控水兩種旱處理條件下，外源褪黑素的施用對玉米幼苗根系發育和抗旱性影響的具體表現，深入了解褪黑素改善植物抗旱性的的生理和生化機制，旨為大田中褪黑素的施用方法提供新的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種子 玉米B73 自交系（2017 年10 月收于中國農業科學院廊坊實驗基地）。

1.1.2 試劑 褪黑素（購買于Sigma，配制方法：將褪黑素用無水乙醇稀釋至100 mmol/L，作為儲液保存在-20℃冰箱中），營養液（Hoagland Modified Basal Salt Mixture，H353，Phytotechlab），PEG6000，磷酸緩沖液，過氧化氫（H2O2）含量測定試劑盒（南京建成公司），過氧化物酶（POD）試劑盒（南京建成公司），丙二醛（MDA）含量測定試劑盒（南京建成公司），超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（索萊寶公司），過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒（南京建成公司），硝基藍四唑（NBT）（Amresco，0.1 g NBT溶于50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液中），營養土。

1.1.3 儀器和工具 萌發紙（購買于Anchor Paper

公司），恒溫培養箱（LHS-80），便攜式光合系統CIRAS-3（PP Systems，Amsbury，MA，USA A）儀器，植物效率分析儀（Handy PEA，Handy Plant Efficiency Analyzer），SPAD-502 meter（Konica Minolta，Japan）葉綠素含量測定儀，A3 尺寸平板掃描儀（MICROTEK Plantom，9900XL），萬深LA-S 系列植物圖像分析系統-根系分析系統。

1.2 方法

1.2.1 浸種盆栽法 用6%次氯酸鈉溶液清洗種子20 min達到滅菌的效果，在蒸餾水中漂洗5次后風干。滅菌后的種子放入不同濃度（0 μmol/L，50 μmol/L，500 μmol/L）的褪黑素溶液中1 min，濾紙也用同樣濃度褪黑素溶液潤濕后置于14 cm 的培養皿中，然后將處理過的種子置于用相同濃度褪黑素浸濕的濾紙上，在27℃恒溫培養箱中暗培養。種子萌發后移栽至盆中。這些種子分為兩組，第一組將0 μmol/L濃度褪黑素浸泡的種子和50 μmol/L 濃度褪黑素浸泡的種子（每種濃度9 粒種子）栽在長方形的裝滿營養土的塑料容器（長50 cm，寬30 cm，深15 cm）。第二組將0 μmol/L 濃度褪黑素浸泡的種子和500 μmol/L 濃度褪黑素浸泡的種子（每種濃度9 粒種子）栽在相同的塑料容器中。這些植株平均地生長在溫室中。當幼苗發育出四片完全的葉子（處于V4 生長階段）時，通過停止灌溉使它們處于漸進的缺水狀態，直到觀察到明顯的葉片萎縮，此時土壤含水量接近于0。然后進行相關生理生化指標的測定。

1.2.2 水培根灌法 我們基于水培根灌法來評估外源性褪黑素的施加對根系構型發育的影響。將已消毒的種子放在雙層棕色萌發紙上，然后卷起來，并垂直放置在2 L 的燒杯中，加入400 mL 的營養液，置于光照恒溫培養室中培養生長（培養條件是28℃，16 h 光照，100 μmol/（m2·s）光照強度；22℃，8 h 黑暗；濕度60%）。種子在萌發紙上萌發5 d 后，發芽卷紙被分為4 組，包括對照組（只添加營養液），試驗組I（營養液+15% PEG6000），試驗組II（營養液+1 μmol/L 褪黑素），試驗組III（營養液+15% PEG6000+1 μmol/L 褪黑素）。所有幼苗再培養7 d，然后收集根系和地上部分，進行根系構型分析和生理生化實驗。培養液每兩天更換一次。

1.2.3 玉米根系構型分析 手動對玉米根系構型進行分析，包括主根長度，側根數目和種子根長度等。隨后，將幼苗根系放置在掃描儀上，使其漂浮在A3尺寸平板掃描儀的丙烯酸托盤中的水中，避免根系重疊和交叉。通過萬深LA-S系列植物圖像分析系統-根系分析系統分析，獲得根系的長度，表面積，體積和平均直徑等。對4 個獨立實驗的所有植株根系構型都進行測量，每個實驗有32 株玉米幼苗。

1.2.4 葉片氣體交換參數、葉綠素熒光和葉綠素含量的測定 利用便攜式光合系統儀器測定植物的氣體交換參數。當土壤中種植的植物葉片發生萎蔫時，在上午（10：00-12：00）時間對植株的第4 片葉子進行氣體交換參數測量。同時，使用植物效率分析儀和SPAD 葉綠素儀在相同葉片上測定葉綠素熒光和葉綠素含量。每片葉子進行了3 次獨立的測量后取平均值。每個處理條件下測定5 株植株。

1.2.5 測定葉片相對含水量（RWC）和地上及地下部分干重 在進行了上述的光合作用測量之后，采集相同的葉片，按照Turner 中描述的方法對葉片的相對含水量進行測定［22］。從葉中脈和邊緣之間的區域剪下5 cm2的葉片樣本（避免使用大葉脈），并將其置于預先稱重的密封的小瓶中進行稱重，獲得葉片的新鮮重量（FW），然后在室溫下將其浸入蒸餾水中8 h，稱量獲得葉片的飽和重量（TW）。樣品在80℃下烘干24 h，稱量獲得葉片的干重（DW）。葉片RWC 根據以下公式進行計算。

對于盆栽的植物，取得所有地上組織并烘干3 d（85℃），以確定地上所有部分干重。對水培紙卷培養的植株，將根系部分和地上部分進行分離然后測定。每個處理收集9 個樣品進行數據測量。

1.2.6 活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）測定 根據H2O2測定試劑盒中所述的方法測定葉片過氧化氫（H2O2）的含量。根據脂質過氧化（MDA）檢測試劑盒的方法測定MDA 的含量。采用原位組織化學染色方法檢測超氧陰離子（O2-）的積累。取離體葉片真空浸于NBT 溶液中，放置于25℃黑暗中2 h，然后將樣品取出在95%乙醇煮沸去除葉綠素，并拍照記錄。

1.2.7 抗氧化酶的活性測定 取0.1 g 葉片樣品在冰態磷酸鹽緩沖液中研磨，獲得組織勻漿。然后將組織勻漿在4℃下，以4 000 r/min 離心10 min，取上清液進行抗氧化酶活性的測定。其中蛋白質濃度的測定使用的是BCA 蛋白濃度測定試劑盒。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定使用的是超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒，過氧化氫酶（CAT）活性測定使用的是過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒，過氧化物酶（POD）活性測定采用過氧化物酶（POD）活性檢測試劑盒。

1.2.8 統計分析 數據分析采用方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異（LSD）檢驗，采用SPSS 數據處理系統。P＜ 0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 褪黑素促進玉米生長發育

水培條件下對玉米植株根部直接施加褪黑素。對地上部分的表型進行觀察，正常條件下，褪黑素的施加對植物地上部分的生長發育沒有影響。在干旱條件下，植物的生長受到抑制，褪黑素的施加緩解了這種抑制（圖1-A）。在盆栽種植條件下，對玉米植株采用種子浸泡褪黑素方法。對地上部分的表型進行觀察，正常條件下，施加褪黑素對植物地上部分的生長發育影響不顯著。在干旱條件下，植物的生長受到抑制，褪黑素的施加緩解了這種抑制（圖1-B）。對玉米的根系和地上部分生物量進行測定，采用根灌褪黑素的方法，在正常條件下，褪黑素的施加對植物的地上部分生物量沒有明顯影響，但施加褪黑素的植株根系生物量為0.077 6 g，未施加褪黑素的植株根系生物量為0.061 5 g，褪黑素的施加顯著提高玉米幼苗的根系發育。在PEG6000 誘導的干旱脅迫條件下，施加褪黑素的植株無論是地上部分還是根系，生物量都顯著高于未施加褪黑素的植株（圖1-C）。采用種子浸泡褪黑素的方法，在正常條件下和干旱脅迫條件下，施加褪黑素的植株地上部分生物量顯著高于未施加褪黑素的植株，其中干旱條件下不同濃度（0 μmol/L vs 50 μmol/L vs 500 μmol/L）褪黑素浸種的玉米幼苗地上部分的生物量分別為0.353 g、0.492 g 和0.307 g（圖1-D）。

圖1 水培根灌和浸種盆栽兩種外源褪黑素施加方式對植物生長發育的影響

2.2 外源褪黑素促進玉米根系發育

我們總共測量了11 個根系參數，并分為3 大類，包括總根，主根和種子根。如表1 所示，玉米根系構型的特征包括根的長度、數量、表面積、體積等。選取了具有代表性的正常條件下和PEG 誘導的干旱條件下的根系掃描圖像（圖2），施加褪黑素的植株在正常條件和PEG 誘導的干旱條件下根系比未施加的植株更龐大強壯。

對玉米幼苗根系的掃描圖像進行統計分析，計算出11 個性狀的平均值和標準偏差，并進行ANOVA 分析，統計結果如表2 和表3 所示。正常條件下施加褪黑素的植株根系和對照組有顯著性的差異。施加褪黑素的玉米根系在長度，表面積，體積，以及側根的數目等都顯著高于未施加褪黑素的玉米植株。其中差異性最明顯的主要表現在主根的長度（PRL），主根的體積（PRV）以及主根上側根的數目（LRNPR）。相比于未施加褪黑素的植株根系，施加褪黑素的植株根系PRL 提高了37%，PRV 增加了6%，LRNPR增加了15%。PEG6000誘導的干旱條件下，玉米幼苗的根系發育受到的一定的抑制，在根系直接添加褪黑素可以緩解根系發育受到的抑制。其中未施加褪黑素的植株總根長（TRL）下降了29.71%，總根表面積（TSA）下降了42.3%，總根體積（TRV）下降了41.1%。施加褪黑素的植株TRL 只下降了12.1%，TSA 下降了5.8%，TRV 下降了16.8%。

2.3 干旱條件下外源褪黑素的施加減少ROS和MDA的積累

對水培植株的葉片、根系和盆栽植株的葉片采用組織化學染色和分光光度法分析兩種主要活性氧（O2-和H2O2）以丙二醛（MDA）的含量。干旱條件下，外源褪黑素的施加能夠降低O2-在葉片中的積累（圖3-A，3-B）。正常澆水條件下，直接添加褪黑素和種子浸泡褪黑素兩種施加方式對植物葉片和根系中H2O2的含量的無明顯影響。干旱條件下葉片和根系都表現出明顯的H2O2積累，根灌褪黑素和種子浸泡褪黑素兩種施加方式都顯著減少了H2O2的積累（圖3-C，3-D），其中根灌褪黑素幼苗的葉片和根系中H2O2的含量相比未施加褪黑素的植株分別下降了34.3%，36.59%。不同濃度（0 μmol/L、50 μmol/L 和500 μmol/L）褪黑素浸種的幼苗葉片中H2O2的含量分別是4.676 μmol/g、3.196 μmol/g 和3.168 μmol/g。

在正常條件下，采取上述兩用方式施加褪黑素對丙二醛含量沒有影響，但是干旱條件會導致葉片和根系中MDA 的積累，褪黑素的施加會降低MDA 的含量，減少MDA 的積累（圖3-E，3-F）。干旱條件下，根灌褪黑素幼苗的葉片和根系中MDA 的含量相比未施加褪黑素的植株分別下降了38.6%，29.5%。 不 同 濃 度（0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L）褪黑素浸種的幼苗葉片中H2O2的含量分別是2.117 nmol/g、1.451 nmol/g 和1.435 nmol/g。

表1 玉米根系構型構相關特征概述

圖2 具有代表性的正常條件下和PEG6000 誘導的干旱條件下的根的掃描圖像

表2 正常條件下水培根灌褪黑素對根系構型相關性狀影響的統計總結

表3 PEG6000 誘導的干旱脅迫條件下水培添加褪黑素對根系構型相關性狀影響的統計總結

2.4 外源褪黑素提高玉米幼苗的相對含水量（RWC）

如圖4-A，使用卷紙水培法，在正常條件下，褪黑素的施加對植株葉片的相對含水量沒有明顯的影響，而在PEG6000 誘導的干旱脅迫條件下，葉片的相對含水量會降低，褪黑素的施加會抑制相對含水量的下降，施加褪黑素的植株相對含水量為85.9%，未施加褪黑素的植株相對含水量為63.6%。同樣在盆栽條件下，干旱脅迫8 d 后，經褪黑素處理的植株相對含水量顯著高于未處理的植株。未處理植株的相對含水量是46.56%，50 μmol/L 褪黑素處理的植株葉片的相對含水量是50.83%，500 μmol/L褪黑素處理的植株葉片的相對含水量是50.43%（圖4-B）。

2.5 干旱條件下外源褪黑素增強玉米的抗氧化系統

測定兩種褪黑素施加方法在正常條件下和干旱脅迫條件下對植物抗氧化酶（POD、CAT、SOD）的活性的影響，實驗結果表明，在水分充足的條件下，兩種外源褪黑素的施加都對抗氧化酶的活性沒有明顯的影響。PEG6000 誘導的干旱脅迫條件和自然干旱條件會導致抗氧化酶活性的增加，其中根灌褪黑素的植物葉片中SOD、CAT 和POD 活性比未施加褪黑素的植株分別提高了9.34%、14.62%、8.48%，根系中SOD、CAT 和POD 活性分別提高了9.65%、27.21%、10.89%。種子浸泡褪黑素的植株葉片SOD、CAT 和POD 活性同樣高于種子未浸泡褪黑素的植株（ 圖5），0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L濃度褪黑素處理條件下盆栽植物葉片的SOD 活性為4.348 U/mL、5.4 U/mL、5.39 U/mL、CAT 活性為46.885 U/（mg protein）、54.23 U/（mg protein）、52.39 U/（mg protein），POD 活性為113.85 U/（mg protein）、139.91 U/（mg protein）、138.52 U/（mg protein）。

2.6 干旱條件下外源褪黑素的施加提高玉米幼苗的光合作用

測量氣體交換參數，實驗結果表明，褪黑素的施加對正常條件下的氣體交換參數影響不顯著。在干旱脅迫條件下，蒸騰速率、光合速率和氣孔導度均顯著降低。然而，褪黑素的應用在一定程度上抑制了這種下降。干旱脅迫條件下，褪黑素處理的玉米幼苗葉片氣孔導度、蒸騰速率和光合速率均高于未處理的玉米幼苗（圖6-A，6-B，6-C）。0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L 濃度褪黑素處理的植物葉片氣孔導度分別為41.25 mmol/（m2·s）、50.625 mmol/（m2·s）、51.25 mmol/（m2·s），蒸騰速率分別為1.307 mmol/（m2·s）、2.285 mmol/（m2·s）、2.236 mmol/（m2·s），光合速率分別為11.96 μmol/（m2·s）、14.68 μmol/（m2·s）和13.8 μmol/（m2·s）。

測定玉米葉片的葉綠素濃度，實驗結果表明，在正常條件下，葉片葉綠素濃度（以SPAD 的形式評估）不受褪黑素施加的影響。經過8 d 的干旱脅迫后，葉綠素濃度明顯降低，0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L 濃度褪黑素處理的植物葉片葉綠素濃度分別為36.115、45.975 和45.575，即褪黑素處理的幼苗葉綠素濃度高于未處理的幼苗（圖6-D）。

對玉米葉片的葉綠素熒光進行測定，實驗結果表明，在正常澆水條件下，施加褪黑素對玉米葉片的葉綠素熒光沒有顯著的影響。在干旱脅迫下，植物葉片的葉綠素熒光會顯著下降，0 μmol/L、50 μmol/L 和500 μmol/L 濃度褪黑素處理的植物葉片葉綠素熒光值分別為0.608、0.671 和0.657，所以經過褪黑素浸種的植株葉綠素熒光的下降得到了明顯地抑制（圖6-E）。

3 討論

眾所周知，非生物脅迫可以抑制作物的生長、發育和生產。最近的研究表明，一些化合物可以使植物更好地抵抗非生物脅迫。褪黑素是一種新型的植物激素和啟動劑，2008 年，Wei 等［23］在擬南芥中發現了第一個植物褪黑素的受體（CAND2/PMTR1），研究發現植物褪黑素通過阻止H2O2和Ca2+信號實現對異源三聚體G 蛋白α 亞單位的調節，與CAND2/PMTR1受體結合，導致氣孔關閉。據報道，褪黑素在植物生長和發育的調控中發揮關鍵作用，且能減輕非生物脅迫引起的氧化損傷［24］。顯然，這些生理過程可能通過尚未確定的植物受體/其他結合生物分子進行調控，需要對受體依賴的植物褪黑素信號在其他生理過程中的作用進行深入研究。

圖3 水培根灌和浸種盆栽兩種褪黑素處理方式對ROS 和MDA 含量的影響

圖4 水培根灌和浸種盆栽兩種褪黑素處理方式對植株葉片相對含水量的影響

植物通過改變水分利用減少干旱脅迫造成的不良影響。地上部分通過氣孔控制蒸騰來減少水分損失，地下部分則不斷擴大強壯根系來保持足夠的水分吸收。發達的根系是植物營養生長和果實發育的基礎。近年來，植物根系已成為國內外許多研究的中心問題。根系的生物量、長度、密度和深度等性狀是干旱環境下影響最終產量的主要抗旱性狀［25-26］。深的根系有助于從相當深的土壤中提取水分［27］。根是植物適應干旱的重要器官，深的根系使玉米能夠獲得土壤深處的水分，這被認為是決定玉米抗旱性的重要因素。在許多植物中，褪黑素已被證明能促進根的生長。外源性褪黑素對野生芥菜黃化幼苗的刺激作用表現出濃度依賴性。0.1 mmol/L褪黑素的應用也提高了芥菜根中內源性游離吲哚乙酸的水平［28］。在甜櫻桃砧木的實驗中也發現了類似的效應，低濃度的褪黑素對砧木的根數和根長有自生反應，而高濃度的褪黑素對所有的砧木都有生根抑制作用［29］。但是這種差別反應的機制仍然未知。Zhou 等［30］研究發現GmDREB1在轉基因植物中可以調節褪黑素的合成，增加褪黑素的含量，從而減輕干旱脅迫對根系發育的抑制作用。在本研究中，通過對植株根系形態的對比分析，結果表明外源褪黑素的施加可以促進主根的伸長和增加側根的數量，增大根系的表面積、體積，使其擁有更豐富的根系。在PEG 誘導的干旱條件下，施加褪黑素能使受到抑制的植株根系生長得到緩解。同時褪黑素的施用減輕了干旱脅迫對玉米幼苗生長的抑制程度。結果表明，褪黑素可能通過調節根系生長提高植物抗旱性，但是具體的機制還需要有進一步的研究。

圖5 水培根灌和浸種盆栽兩種褪黑素處理方式對玉米植株抗氧化酶活性的影響

圖6 褪黑素浸種對氣體交換參數，葉綠素含量，葉綠素熒光以及相對含水量的影響

為了減少干旱脅迫誘導的ROS 積累，植物進化了出一系列復雜的酶和非酶防御系統來抵御氧化損傷［31］。植物細胞的抗氧化防御系統包括酶性抗氧化劑（POD、CAT、SOD、APX、GPX、GR 和DHAR）和非酶性抗氧化劑。許多研究發現抗氧化酶活性可以響應滲透脅迫［32］，外源褪黑素可以調節一些抗氧化酶活性來緩解脅迫誘導的植物活性氧的積累［33-34］。先前的研究表明，外源褪黑素可以誘導內源一氧化氮的產生［35］，一氧化氮（NO）已經成為植物中一種重要的信號分子，因此，一氧化氮是褪黑素增強非生物脅迫的耐受性所必需的，其可下調miR398 表達以激活ROS 清除酶活性并促進相關基因的表達并最終清除細胞內ROS［36］。在小麥中，褪黑素處理可清除活性氧積累，并通過刺激抗氧化酶和增加抗氧化劑來減輕鋁誘導的脂質和蛋白質的氧化損傷［37］。MzASMT1在擬南芥中的過表達顯著降低了活性氧的產生，且植物比野生型植株表現出更好的抗旱能力［38］。同時，植物褪黑素還可以提高細胞器的抗氧化能力，調節C-重復序列結合因子（CBFs）等逆境反應基因的表達，從而提高植物在受到各種非生物逆境脅迫時的抗逆性［39-40］。這些研究都表明，抗氧化酶活性響應滲透脅迫，褪黑素可以調節部分抗氧化酶活性，緩解植物在干旱脅迫下誘導的ROS 的積累［33-34］。在本研究中，直接施加褪黑素和褪黑素浸種兩種方法都提高了根系和葉片的抗氧化酶（包括SOD、CAT 和POD）的活性，減少了H2O2和MDA 的積累，這些結果與先前大豆的研究是一致的，褪黑素可以直接清除ROS，還可以促進其他抗氧化劑和抗氧化酶的積累，間接清除ROS，從而調節玉米幼苗細胞的氧化平衡，維持細胞內ROS 濃度，防止活性氧積累，從而減少干旱脅迫對膜脂質過氧化造成的損害，提高玉米幼苗的抗旱性。2019 年Arnao 等［41］提出了一個模型，認為植物褪黑素的作用都與氧化還原網絡的不同調節元件（如活性氧ROS 和活性氮RNS）通過H2O2和NO的作用聯系在一起。ROS、RNS 和植物褪黑素形成了一個三聯體，調節植物體中的氧化還原網絡，但是這些元件如何在不同的生理情況下調節氧化還原動態平衡目前還不清楚。

光合作用是植物利用光能驅動有機化合物合成的物理化學過程，是植物生產的基礎。干旱是一種嚴重的抑制光合作用的環境脅迫。通常認為，水分脅迫下光合速率下降的主要原因是由氣孔關閉引起的環境CO2擴散到羧化部位的限制。褪黑素可以作為光合作用和氣孔導度的增強劑或保護劑，上調光系統、電子轉運體和ATP 酶基因的許多元素。褪黑素處理植株表現出凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、光系統II 量子效率和光合電子傳遞速率的增加。褪黑素還通過調節保衛細胞陰離子通道蛋白和脫水蛋白來優化惡劣條件下的氣孔功能，增加氣孔張開程度，增加二氧化碳的利用率。在Calvin 循環中，褪黑素調節Rubisco 元件、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和糖酶的表達。此外，ASC-GSH 循環、TCA 循環以及肌醇和脂肪酸生物合成途徑的元素也受到褪黑素的調節［42］。已有研究表明，在干旱條件下，褪黑素處理的蘋果幼苗保持了顯著較高的CO2同化率和氣孔導度，與未經處理的蘋果相比，褪黑素處理的蘋果在干旱脅迫下保持了較高的光合速率［29］。同時干旱脅迫通常會導致葉片中PSII 的損傷［20，43-46］。氣孔是植物葉片進行氣體交換的主要通道，在光合作用和呼吸作用中起著重要的作用。褪黑素的應用提高了蘋果和葡萄的氣孔導度［47］。在本研究中，以Fv/Fm的表達為代表的PSII 光合效率在經褪黑素處理的植株中擁有在比未處理植株更高的數值。這些結果表明褪黑素對干旱誘導的光合系統損傷具有保護作用。此外，對氣孔導度，光合速率，蒸騰速率進行測定，種子浸泡褪黑素的玉米植株顯著高于未處理的的植株，因此褪黑素可能通過提高植物的光合效率提高植物的抗旱性。

褪黑素不僅能夠促進植物的萌發、生長和繁殖，還能促進果實的成熟［4］。褪黑素處理可以上調乙烯信號轉導相關基因的轉錄，從而誘導果實成熟和軟化，使番茄（Solanum lycopersicumL.）具有更好的色澤和風味［48］。此外，Sun 等［49］蛋白質組學分析表明，褪黑素處理提高了與花青素積累相關的蛋白含量。盡管對褪黑素在調控植物生長發育的分子和代謝機制方面的研究有了很大的進展，但對該領域的研究仍然面臨著很多挑戰，包括褪黑素的受體以及褪黑素代謝物，它們在調節植物在逆境條件下的各種上下游信號級聯中都發揮著明顯的功能。

本研究揭示了褪黑素可能通過促進玉米植株的生長發育，促進光合作用抗氧化作用提高植株抗非生物脅迫的能力。之前的研究大多采用根灌褪黑素或者葉面噴灑褪黑素兩種方式來提高玉米的抗生物脅迫能力［50-51］。本研究則采用浸種的方式探討干旱脅迫下外源褪黑素對玉米對抗氧化酶的影響，這些發現為外源性褪黑素在玉米增產中的潛在應用奠定了基礎，也為深入研究褪黑素介導的玉米植株抵抗干旱脅迫的分子機制提供了依據。

4 結論

本文主要研究了褪黑素對玉米幼苗根系發育和抗旱性的影響。首先，褪黑素促進根系發育，與對照相比，顯著提高了主根和種子根的長度，側根數量和根系總長度，總表面積，促進植物土壤水分的吸收；其次，褪黑素的施加提高了抗氧化酶（SOD，POD，CAT）的活性，強化了玉米抗氧化系統，從而可以降低干旱誘導的活性氧積累，幫助植物維持較高的PSII 光合效率，增強植物的光合作用，從而提高了植物的抗旱性。褪黑素參與了干旱條件下植物水分狀況的調節，在干旱條件下了提高玉米葉片的相對含水量。